桑樹PAMP途徑中相關(guān)基因分析和功能研究.pdf

1、高等真核生物識(shí)別微生物的侵染主要依賴于一系列的模式識(shí)別受體pattern recognitionreceptors（PRRs）。這些PRRs能夠識(shí)別出一些病原微生物中保守分子結(jié)構(gòu)-病原相關(guān)分子模式pathogen-associated molecular patterns(PAMPs)。PAMPs在動(dòng)物先天免疫中扮演著重要的角色，而在植物中，它們同樣作為激發(fā)子激活了防御信號(hào)。這種能夠辨別高度保守分子的識(shí)別機(jī)制可能通過趨同進(jìn)化在不同生物界

2、獨(dú)自出現(xiàn)。植物能夠識(shí)別組成真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和甾醇麥角固醇，同樣也能夠識(shí)別細(xì)菌內(nèi)的lipopolysacharides(LPS)、冷擊蛋白(CSP)、鞭毛蛋白和EF-Tu。植物具有多種多樣的病原微生物模式分子(PAMPs)，但是相應(yīng)PRRs、下游的響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和一些相關(guān)的防御蛋白以及它們之間的相互關(guān)系并不是很清楚。
　　桑樹（Morus L.）屬于?？疲∕oraceae），為我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種。我國擁有豐富的桑屬資源，作為家蠶的

3、主要飼料，桑葉生產(chǎn)是蠶桑產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。桑樹病蟲害始終是威脅蠶桑產(chǎn)業(yè)的重要隱患。它們不僅造成桑葉大幅減產(chǎn)，養(yǎng)蠶數(shù)量下滑，同時(shí)了制約桑樹在藥用和生態(tài)保護(hù)中發(fā)揮重要作用。本文通過研究桑樹PAMP途徑中的基因與功能，篩選出靶標(biāo)基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證其功能，這對于研究桑樹的抗生物脅迫具有重要的意義。
　　本文研究結(jié)果:
　　1.桑樹中PAMP相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析
　　從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫中共獲得14個(gè)LysM蛋白基因、56個(gè)W

4、RKY轉(zhuǎn)錄因子、20個(gè)幾丁質(zhì)酶基因。通過生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示這些基因家族含有各自保守的蛋白質(zhì)序列，上游調(diào)控序列中都含有一些響應(yīng)植物免疫（JA、SA、真菌、刺激子、傷口）的調(diào)控元件，其中一些蛋白質(zhì)和已經(jīng)報(bào)道過的蛋白序列高度相似，所以這些基因可能參與植物的PAMP防御免疫反應(yīng)。
　　2.桑樹PAMP途徑上的關(guān)鍵基因響應(yīng)生物和擬生物脅迫后的表達(dá)分析
　　為了探究可能參與PAMP途徑中的各個(gè)基因的表達(dá)水平是否存在內(nèi)在的聯(lián)系，本論

5、文通過qPCR探究了11個(gè)基因在應(yīng)對不同脅迫后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:MnCERK1作為PAMP途徑的上游激發(fā)子的識(shí)別受體，在受到生物脅迫和擬生物脅迫處理后，MnCERK1基因都不同程度受到誘導(dǎo)表達(dá)。幾丁質(zhì)處理和家蠶咬食后，桑樹中的4個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子都呈現(xiàn)出不同程度的表達(dá)，在以前的報(bào)道中，4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作為PAMP途徑上的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠響應(yīng)幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)，而昆蟲咬食一般會(huì)觸發(fā)JA的免疫途徑，這可能暗示這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在下游參與這兩種免疫途

6、徑，且都是正調(diào)控。植物的幾丁質(zhì)酶一般被認(rèn)為參與植物的防御。選取6個(gè)分屬于不同分類的桑樹幾丁質(zhì)酶，在受到擬生物脅迫時(shí)，它們都能夠被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);而在家蠶咬食后，只有幾丁質(zhì)酶Mnchi16被顯著的誘導(dǎo);真菌處理后，Mnchi8也呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)的表達(dá)模式，擬生物和生物脅迫誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)存在顯著的差異。
　　3.Mn WRKY29和Mnchil4基因的克隆和煙草遺傳轉(zhuǎn)化
　　為了進(jìn)一步研究MnWRKY29和Mnchil4是否是PA