淋巴細(xì)胞微粒對(duì)氣道上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬探討LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞的作用及其可能機(jī)制，并闡明LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分。
　　方法:
　　1.LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞作用的研究
　　1.1 LMPs的提取和鑒定
　　1.2 LMPs對(duì)人氣道上皮細(xì)胞的作用
　　1.3 LMPs對(duì)小鼠氣道上皮和肺上皮的作用
　　2.LMPs誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究
　　2.1LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞caspa

2、se的影響
　　2.2 LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　2.3 LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激上下游機(jī)制的影響
　　3.LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用的關(guān)鍵成分
　　3.1使用PSR抗體中和氣道上皮細(xì)胞表面抗原PSR，免疫熒光染色檢測(cè)Dil-LMPs內(nèi)化入氣道上皮細(xì)胞的變化情況。
　　3.2 Western blot檢測(cè)LMPs上FasL的表達(dá)。使用FasL抗體中和LMPs上的FasL蛋白后

3、，MTT檢測(cè)對(duì)氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　3.3高溫滅活LMPs后，MTT檢測(cè)對(duì)氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞作用的研究
　　1.1LMPs的提取和鑒定結(jié)果
　　細(xì)胞松弛素D誘導(dǎo)后成功獲得LMPs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)顯示LMPs直徑小于1μm，annexinⅤ陽(yáng)性率是75.73％，符合MPs的特性。
　　1.2 LMPs對(duì)人氣道上皮細(xì)胞的作用
　　1.2.

4、1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
　　光學(xué)顯微鏡和透射電鏡均可觀察到LMPs導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。如細(xì)胞發(fā)生皺縮、出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)、空泡形成、胞核深染、染色體濃縮和胞膜結(jié)構(gòu)改變，甚至凋亡小體形成、細(xì)胞發(fā)生壞死。
　　1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖檢測(cè)結(jié)果
　　(1)低濃度的LMPs（1μg/ml和2μg/ml）不影響細(xì)胞生長(zhǎng)(p＞0.05)。濃度為5-40μg/ml時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)（p都＜0.001）。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨著LMPs濃度的增加和

5、刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加大。提示LMPs抑制細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。
　　(2) Ki-67染色顯示LMPs可使細(xì)胞的增殖率從對(duì)照組的60％下降到39.1％(24 h)、12.6％(48 h)或3.3％(72 h)。提示LMPs抑制細(xì)胞增殖具有時(shí)間依賴性。
　　1.2.3凋亡檢測(cè)結(jié)果
　　AnnexinⅤ和PI雙染結(jié)果顯示LMPs刺激后，AnnexinⅤ的單陽(yáng)性率，AnnexinⅤ+PI雙陽(yáng)性率和Annexin

6、Ⅴ總陽(yáng)性率均明顯增高。且LMPs在20μg/ml時(shí)作用明顯，已有明顯的促凋亡作用。
　　1.2.4免疫熒光染色檢測(cè)LMPs和細(xì)胞的作用方式
　　(1)隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞胞漿內(nèi)Dil-LMPs的量逐漸增加，孵育16 h后Dil-LMPs幾乎完全進(jìn)入胞漿，提示LMPs進(jìn)入細(xì)胞具有時(shí)間依賴性。隨著Dil-LMPs濃度的增加（5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml），進(jìn)入細(xì)胞胞漿內(nèi)Dil-LMPs的量逐漸增加，表明LMP

7、s進(jìn)入細(xì)胞也具有濃度依賴性。
　　(2)吞噬抑制劑細(xì)胞松弛素D處理細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞胞漿的Dil-LMPs大大減少。溶酶體抑制劑氯喹處理細(xì)胞使胞漿內(nèi)的聚集Dil-LMPs增多。這從正反兩方面說明LMPs進(jìn)入細(xì)胞的方式是通過細(xì)胞的吞噬作用實(shí)現(xiàn)的。
　　1.3 LMPs對(duì)小鼠氣道上皮和肺上皮的作用
　　1.3.1組織病理學(xué)觀察和TUNNEL原位末端凋亡檢測(cè)結(jié)果
　　掃描電鏡、HE染色和TUNNEL染色檢測(cè)LMPs誘導(dǎo)的

8、體外培養(yǎng)的支氣管和肺組織，發(fā)現(xiàn)LMPs使支氣管上皮和肺泡上皮損傷，組織排列紊亂、細(xì)胞發(fā)生凋亡（TUNNEL染色呈棕色）。從組織培養(yǎng)和不同種屬來源角度證實(shí)了LMPs誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞凋亡具有普遍性，與細(xì)胞的種屬無關(guān)。
　　2.LMPs誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究
　　2.1LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞caspase的影響
　　(1) LMPs刺激4h時(shí)，氣道上皮細(xì)胞內(nèi)caspase-8和-9酶活性達(dá)到峰值（與對(duì)照組比，p＜

9、0.05）;刺激8h時(shí)，caspase-3酶活性達(dá)到峰值（與對(duì)照組比，p＜0.05）。Westernblot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)LMPs使細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)增加（與對(duì)照組比，p＜0.05）。(2) caspase抑制劑Z-VAD-FMK逆轉(zhuǎn)LMPs介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的增加(與LMPs組比，p＜0.05)。故caspase-3參與了LMPs誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。
　　2.2LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　2.2.1 M

10、DA、超氧化物、ROS和GSH的檢測(cè)結(jié)果
　　LMPs均可增加16HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物MDA、超氧化物、ROS的含量（p均＜0.05）。但是，LMPs處理細(xì)胞后，細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化物GSH的量減少(p＜0.001)。
　　2.2.2凋亡分析結(jié)果
　　20μM的氧化應(yīng)激抑制劑NAC預(yù)處理細(xì)胞可使LMPs介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的AnnexinⅤ單陽(yáng)性率從14.8％下降到3.22％，使A549細(xì)胞從17.4％下降到4

11、.60％，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.05）。結(jié)果表明NAC可逆轉(zhuǎn)LMPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　2.3 LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激上下游機(jī)制的影響
　　2.3.1 Western blot檢測(cè)MAPK家族蛋白的變化
　　Western blot結(jié)果顯示，LMPs處理16HBE和A549細(xì)胞后，從30 min開始，與對(duì)照組相比，兩種細(xì)胞中磷酸化p38表達(dá)均增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.05）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩

12、種細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38的表達(dá)逐漸增加。結(jié)果表明LMPs激活了氣道上皮細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　1.3.2 ELISA檢測(cè)AA的含量變化
　　(1) ELISA結(jié)果顯示，LMPs將16HBE細(xì)胞產(chǎn)生的AA的含量從對(duì)照組的23.01±2.59μg/ml增加到45.42±2.32μg/ml(p＜0.05)，將A549細(xì)胞從對(duì)照組的23.01±0.77μg/ml增加到40.51±2.25μg/ml(p＜0.05)。而2

13、0μg/ml LMPs僅含有少量的AA，為3.49±0.54μg/ml。
　　(2)吞噬抑制劑細(xì)胞松弛素D逆轉(zhuǎn)LMPs介導(dǎo)的AA的生成(p＜0.05)，表明LMPs可刺激內(nèi)源性AA的產(chǎn)生。
　　2.3.3AA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　細(xì)胞DNA含量流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，100μM的AA將16HBE細(xì)胞和A549的凋亡率從對(duì)照組的0％分別增加到48.04％和50.37％;將細(xì)胞內(nèi)caspase-3酶活性分別增加了3.99倍和

14、3.17倍（p均＜0.001）。結(jié)果表明AA可顯著增加氣道上皮細(xì)胞的凋亡。
　　2.3.4 p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)AA和ROS的影響
　　使用p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580可將LMPs增加的AA的含量有效逆轉(zhuǎn)27％(p＜0.05);這個(gè)數(shù)值在A549細(xì)胞上是28％(p＜0.05)。同時(shí)，SB203580可有效地降低LMPs介導(dǎo)的ROS的增加（p均＜0.05）。說明AA和氧化應(yīng)激位于p38MAPK信號(hào)傳

15、導(dǎo)通路的下游。
　　2.3.5 AA對(duì)ROS的影響
　　在兩種上皮細(xì)胞中，AA的抑制劑TFP均可逆轉(zhuǎn)LMPs誘導(dǎo)的ROS的增加(p均＜0.05)。故AA調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。
　　2.3.6 AA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　(1) Western Blot結(jié)果顯示TFP逆轉(zhuǎn)LMPs誘導(dǎo)的cleaved caspase-3蛋白的增加。說明TFP可逆轉(zhuǎn)LMPs介導(dǎo)的caspase-3活化。
　　(2) TFP將LMPs誘導(dǎo)的

16、16HBE細(xì)胞凋亡率從9.88％降至1.95％，在A549細(xì)胞上則是從9.08％降至2.26％(p均＜0.01)。但相同劑量的TFP本身不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。說明AA抑制劑TFP可逆轉(zhuǎn)LMPs介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且與TFP本身無關(guān)。
　　3.LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用的關(guān)鍵成分
　　(1)中和細(xì)胞表面抗原PSR后，Dil-LMPs（紅色）進(jìn)入16HBE和A549細(xì)胞胞漿的情況無明顯改變（與Dil-LMPs組相比）。表明PS

17、/PSR信號(hào)不參與LMPs被氣道上皮細(xì)胞吞噬的過程。
　　(2) Western blot顯示，LMPs包含F(xiàn)asL。中和LMPs含有的FasL后，LMPs介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)無改變(p＞0.05)。結(jié)果表明雖然LMPs包含F(xiàn)asL，但Fas/FasL信號(hào)沒有參與LMPs介導(dǎo)的氣道上皮生長(zhǎng)抑制。
　　(3)高溫滅活LMPs后，MTT結(jié)果顯示LMPs顯著抑制氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的特性沒有被改變。提示脂質(zhì)或其他熱耐受成分可能是LM

18、Ps發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分。
　　結(jié)論:
　　1.LMPs導(dǎo)致氣道上皮損傷，誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞凋亡，且無細(xì)胞種屬無關(guān)。
　　2.LMPs進(jìn)入細(xì)胞的方式是通過細(xì)胞的吞噬作用實(shí)現(xiàn)的。
　　3.LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用的具體機(jī)制是活化p38 MAPK信號(hào)通路，刺激花生四烯酸大量聚集，進(jìn)而增加氧化應(yīng)激，激活caspase-3。
　　4.LMPs對(duì)氣道上皮細(xì)胞的促凋亡作用是由LMPs中的脂質(zhì)或其他熱耐受成分引起