“黃海2號(hào)”中國(guó)對(duì)蝦高通量SNP篩選及其與抗WSSV性狀的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蝦類,WSSV制約我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。傳統(tǒng)對(duì)蝦選擇育種模式與分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)相結(jié)合有利于中國(guó)對(duì)蝦抗病品種的選育。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)被認(rèn)為是很有應(yīng)用前景的分子標(biāo)記技術(shù)。本研究在中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組454高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上,依據(jù)預(yù)測(cè)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,利用非標(biāo)記探針 HRM(High Reso

2、lution Melting)技術(shù),對(duì)單核苷酸突變進(jìn)行驗(yàn)證開發(fā)。利用開發(fā)的132個(gè)SNP標(biāo)記(實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)39個(gè)+本論文開發(fā)93個(gè)),對(duì)2008-2012年中國(guó)對(duì)蝦抗WSSV性狀測(cè)試實(shí)驗(yàn)中獲得的抗性群體和敏感群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析,并對(duì)各位點(diǎn)基因型與抗WSSV性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,獲得了與抗WSSV性狀相關(guān)的9個(gè)SNP標(biāo)記。使用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)對(duì)抗WSSV相關(guān)SNP位點(diǎn)Contig1401-67 TA所在基因——中國(guó)對(duì)蝦醛

3、縮酶基因(aldolase)進(jìn)行了成功克隆,并獲得了該基因cDNA全長(zhǎng)序列。
　　具體內(nèi)容如下:
　　一、中國(guó)對(duì)蝦多態(tài)性SNP位點(diǎn)開發(fā)
　　中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組454高通量測(cè)序、contig的拼裝和SNP位點(diǎn)的預(yù)測(cè)由國(guó)家人類基因組南方研究中心完成。依據(jù)預(yù)測(cè)的SNP位點(diǎn),從造成錯(cuò)義突變(mis-sence)的SNP位點(diǎn)中挑選了530個(gè)位點(diǎn),共設(shè)計(jì)合成引物378組,篩選得到候選SNP位點(diǎn)301個(gè)并設(shè)計(jì)非標(biāo)記探針,通過非標(biāo)記探針H

4、RM分型方法,在96尾2012年人工選育的“黃海2號(hào)”中國(guó)對(duì)蝦群體中進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證,結(jié)果共有93個(gè)SNP位點(diǎn)顯示多態(tài)性。每個(gè)SNP位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)均為2個(gè),有效等位基因數(shù)(Ne)分布范圍1.0105~2.000,觀測(cè)雜合度(Ho)的分布范圍為0.000～0.9792,期望雜合度(He)的范圍為0.0104～0.5026,次要等位基因頻率(MAF)分布范圍0.0052～0.5000。多態(tài)信息含量分析顯示93個(gè)位點(diǎn)的PIC,其平

5、均值為0.2182,低于標(biāo)準(zhǔn)值0.5。Shannon信息指數(shù)分布范圍為0.0326～0.6931,平均值為0.3330。研究結(jié)果表明,通過HRM技術(shù)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證開發(fā)是一種有效的方法,開發(fā)獲得中國(guó)對(duì)蝦SNP位點(diǎn)可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　二、中國(guó)對(duì)蝦抗WSSV相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選及關(guān)聯(lián)分析
　　利用132個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)“黃海2號(hào)”中國(guó)對(duì)蝦抗性群體和敏感群體進(jìn)行HRM基因分型分析,并對(duì)基因型分布頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)

6、。結(jié)果顯示,有9個(gè)SNP位點(diǎn)的10個(gè)基因型在抗性群體和敏感群體中分布頻率差異顯著(P﹤0.05),其中C1401-67TA的A/A型、C7695-204AG的A/G型、C283-145AG的G/G型、C12355-592CT的C/C型在兩群體中差異極顯著(P﹤0.01),C6625-56CT的C/T型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C364-89AT的A/A型和C

7、12355-592CT的C/T型差異顯著(P﹤0.05)。進(jìn)一步分析顯示,位點(diǎn)C1401-67TA的A/A型、C6625-56CT的C/T型、C364-89AT的A/A型和C12355-592CT的C/T型與抗病正相關(guān),C7695-204AG的A/G型、C7911-209CT的T/T型、C9733-231TA的T/A型、C12698-488CA的A/A型、C283-145AG的G/G型和C12355-592CT的T/T型與抗病負(fù)相關(guān)。<

8、br>　　借助NCBI網(wǎng)站BlastX程序?qū)Λ@得的與抗病性狀相關(guān)的9個(gè)Contig進(jìn)行分析,推測(cè)其潛在功能。除了Contig12698,其余8個(gè)Contig均匹配到了序列相似度較高的功能基因(E值<10-10),分別是果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase),脫氧胞苷酸脫氨酶(deoxycytidylate deaMase),u5小核核糖核蛋白200解旋酶樣蛋白(u5 small

9、 nuclear ribonucleoprotein200 kda helicase-like protein),甘氨酸脫羧酶(glycine decarboxylase),多態(tài)縮多氨酸(DEAD-box polypeptide39),半胱氨酸天冬酶(effector caspase),肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族1-like(predicted:peptide transporter family1-like),40S核糖體蛋白S2(40S rib

10、osomal protein S2)。
　　三、中國(guó)對(duì)蝦SNP類型特征及分布特點(diǎn)
　　在中國(guó)對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組454高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上,依據(jù)測(cè)序獲得的7萬余個(gè)可能的SNP位點(diǎn)和經(jīng)過HRM驗(yàn)證獲得的多態(tài)性SNP位點(diǎn),分析中國(guó)對(duì)蝦堿基突變的類型及其與周圍堿基的相關(guān)性。結(jié)果表明,C/T突變類型最多,G/C突變類型最少,并且存在“轉(zhuǎn)換偏差”為2.0>0.5;隨著突變位點(diǎn)直接相鄰位置上A&T堿基個(gè)數(shù)的增加,該突變位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換偏差逐漸降低;突變位

11、點(diǎn)發(fā)生突變前后堿基組成存在(G+C)/(A+T)偏差。
　　四、中國(guó)對(duì)蝦抗病相關(guān)基因克隆及全長(zhǎng)序列分析
　　使用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)對(duì)抗WSSV相關(guān)SNP位點(diǎn)Contig1401-67 TA所在基因——中國(guó)對(duì)蝦醛縮酶基因(aldolase)進(jìn)行了成功克隆,并獲得了該基因cDNA全長(zhǎng)序列。序列分析結(jié)果表明,該cDNA全長(zhǎng)2127 bp,包含一個(gè)1098 bp的開放閱讀框,編碼365個(gè)氨基酸。通過對(duì)中國(guó)對(duì)蝦醛縮酶基因核苷