朵麗蝶蘭生物鐘相關(guān)基因DhLHY的克隆與功能驗證.pdf

1、朵麗蝶蘭(Doritaenopsis hybrid)是蝴蝶蘭(Phalaenopsis)與朵麗蘭(Doritis)的雜交種,是蘭科蝴蝶蘭屬多年生附生草本花卉;因其花形酷似蝴蝶、花色豐富艷麗,花期長達3~4個月,在國內(nèi)外花卉市場上深受歡迎,被譽為“蘭中皇后”,是蘭科植物中栽培最廣泛、應(yīng)用最普及的種類之一,具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。
　　本次試驗通過對蝴蝶蘭文庫中LHY相關(guān)序列的搜索分析,以朵麗蝶蘭‘Tinny Tender’(D

2、oritaenopsis‘Happy smile× Happy valentine’)為試材,利用基因克隆技術(shù)獲得DhLHY基因的cDNA全長,對序列進行生物信息學(xué)分析并驗證其功能。研究主要取得以下結(jié)果:
　　1.利用PCR技術(shù)克隆獲得朵麗蝶蘭中DhLHY基因的cDNA全長;DhLHY基因的cDNA序列全長2594bp,包括一個1962bp的ORF區(qū),編碼653個氨基酸。
　　2.通過實時定量PCR分析比較低溫和高溫條件下,

3、植物根、莖、葉中 mRNA表達量的變化,解析生物鐘基因 DhLHY的表達機理,分析 DhLHY基因表達的時空分布,結(jié)果顯示 DhL HY基因在24h內(nèi)表達量隨著光照時間的變化發(fā)生改變,在光照2h后表達量達到高峰,之后隨著光照時間增加,表達量逐漸下降,在傍晚時分達到低谷,進入暗期后,表達量又開始緩慢上升;在整個營養(yǎng)生長階段, DhL HY在根、莖和葉中都有檢測到表達,且表達量變化不顯著,在低溫處理時,DhLHY的表達量高于高溫處理。

4、>　　3.采用蘸花法侵染擬南芥,將構(gòu)建的 pC1301-DhLHY過量表達載體,轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中,利用潮酶素篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥植株并觀察記錄其表型變化,結(jié)果表明,DhLHY轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉型與野生型相比,葉柄縮短,葉片變小,植株的開花時間也有不同程度的延遲,在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)均能檢測到 DhLHY基因的 DNA和RN A,這一結(jié)果與擬南芥中的研究報道大致相同。
　　本研究對于實現(xiàn)通過基因工程手段來人工控制蝴蝶蘭開花的時間、突破蝴