FAM134B基因?qū)ωi脂肪細(xì)胞聚酯分化的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、動物體脂的過度沉積會造成飼料利用率降低、肉品質(zhì)下降等問題。因此，深入了解豬脂肪沉積的規(guī)律，并進(jìn)一步通過營養(yǎng)手段調(diào)控豬體脂的合理分配已成為畜牧產(chǎn)業(yè)亟待解決的問題之一。豬FAM134B基因是通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個與脂肪沉積相關(guān)的關(guān)鍵基因。研究表明，在豬脂肪前體細(xì)胞中，F(xiàn)AM134B能夠調(diào)控細(xì)胞聚酯分化。在人和小鼠細(xì)胞中，F(xiàn)AM134B亞細(xì)胞定位為高爾基體，能影響高爾基體的形狀和體積，進(jìn)而影響高爾基體功能的發(fā)揮。而高爾基體對脂滴有包裝和轉(zhuǎn)

2、運的作用，推測豬FAM134B基因發(fā)揮促進(jìn)脂肪沉積的作用可能與高爾基體有關(guān)，但目前尚未見相關(guān)報道。相比于大鼠和小鼠，人與豬具有更多的相似的基因、代謝功能以及心血管系統(tǒng)，以豬為動物模型來開展脂肪代謝機(jī)制研究，對人類健康更有意義。因此，本研究利用杜長大三元雜交豬的皮下脂肪組織分離細(xì)胞，構(gòu)建豬脂肪前體細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，在研究FAM134B在豬脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律基礎(chǔ)上，利用基因超表達(dá)和沉默技術(shù)研究了FAM134B對脂肪細(xì)胞聚酯分化的影

3、響，其次利用免疫熒光和透射電鏡技術(shù)對豬FAM134B進(jìn)行亞細(xì)胞定位及其對高爾基體形態(tài)的影響，并進(jìn)一步利用共轉(zhuǎn)染技術(shù)探究FAM134B和ARFRP1之間的作用關(guān)系，旨在探討FAM134B基因表達(dá)是否是通過影響高爾基體進(jìn)而影響脂肪沉積，為從基因角度深入探究豬脂肪沉積的分子機(jī)制以及為改善豬肉品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)，同時為人類肥胖相關(guān)疾病提供借鑒。主要研究成果如下:
　　試驗一:豬脂肪前體細(xì)胞體外模型的建立
　　選用5日齡的杜長大三元仔豬

4、，分離得到豬皮下脂肪前體細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)呈梭形。細(xì)胞誘導(dǎo)分化3天后細(xì)胞明顯變圓，誘導(dǎo)5天后，顯微鏡下可見明顯小脂滴，油紅O染色后出現(xiàn)紅色脂滴，初步判斷為豬皮下前體脂肪細(xì)胞。進(jìn)一步，通過q-PCR檢測分化過程中脂肪分化相關(guān)基因PPARγ、 C/EBPα及脂肪分解基因HSL mRNA表達(dá)量變化規(guī)律，結(jié)果表明:脂肪分化關(guān)鍵因子PPARγ的表達(dá)量在誘導(dǎo)后第1天開始增加，并顯著高于第0天(p＜0.05) C/EBPα表達(dá)量在第1、3、5、7

5、和9天顯著高于第0天(p＜0.05)，表達(dá)量持續(xù)升高;分解相關(guān)基因HSL表達(dá)量第3、5、7天顯著高于第0天(p＜0.05)，先升高后降低，與報道結(jié)果一致。提示:脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)3天后進(jìn)入分化狀態(tài)，7天后處于分化成熟期，脂肪在細(xì)胞內(nèi)開始大量沉積，分離得到的細(xì)胞為豬前體脂肪細(xì)胞，滿足進(jìn)一步實驗要求。
　　試驗二:豬FAM134B基因?qū)ωi脂肪細(xì)胞聚酯分化的影響
　　利用熒光定量技術(shù)檢測FAM134B基因在豬脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)

6、規(guī)律，結(jié)果顯示，在細(xì)胞分化過程中FAM134B的mRNA表達(dá)量呈不斷上升趨勢，提示FAM134B基因可能在豬能量代謝和脂肪沉積過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　利用課題組已有的FAM134B超表達(dá)載體并構(gòu)建FAM134B干擾載體，在建立的豬體外脂肪前體細(xì)胞模型上，研究了FAM134B基因超表達(dá)和干擾對豬脂肪細(xì)胞脂肪沉積及脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。超表達(dá)FAM134B顯著增加了細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯含量(p＜0.05)，提高了脂肪分化相關(guān)基因P

7、PARγ，C/EBPα及脂肪合成相關(guān)基因FAS的表達(dá)量(p＜0.05)，同時降低了脂肪分解相關(guān)基因ATGL的mRNA表達(dá)量(p＜0.05)而干擾FAM134B干擾后，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯沉積量減少，且分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和脂肪合成相關(guān)基因FAS的表達(dá)量降低(p＜0.05)。以上結(jié)果均提示:FAM134B在脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。
　　試驗三:豬FAM134B的亞細(xì)胞定位及其對高爾基體轉(zhuǎn)運的影響

8、r>　　FAM134B在人和小鼠細(xì)胞中，定位于高爾基體上，且能夠影響高爾基體的形態(tài)。因此，本實驗通過免疫熒光和透射電鏡技術(shù)，研究豬FAM134B定位及其在豬脂肪細(xì)胞上對高爾基體形態(tài)的影響。免疫熒光結(jié)果顯示，豬FAM134B蛋白與順式高爾基體標(biāo)志蛋白giantin定位重合，表明豬FAM134B蛋白也定位于高爾基體上。
　　超表達(dá)FAM134B后，高爾基體囊膜腫脹，體積增大，囊泡數(shù)量增多，且高爾基體轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白ARF1、ARF6、AR

9、FRP1表達(dá)量顯著升高(p＜0.05)，同時囊泡形成蛋白調(diào)控因子GTPase活性顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。而干擾FAM134B后，高爾基形態(tài)未見明顯變化，但轉(zhuǎn)運囊泡數(shù)量減少，且高爾基體轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白ARF1、ARF6、ARFRP1表達(dá)量顯著降低(p＜0.05)，GTPase活性減弱(p＜0.05)。以上結(jié)果提示，F(xiàn)AM134B影響豬脂肪細(xì)胞聚酯分化可能是通過調(diào)控高爾基體的囊泡轉(zhuǎn)運。
　　試驗四:囊泡轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白ARFRP1對FAM1

10、34B的表達(dá)及脂肪細(xì)胞聚酯分化的影響
　　前期實驗結(jié)果表明FAM134B對囊泡轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)有影響，其中ARFRP1mRNA表達(dá)量在FAM134B超表達(dá)和干擾后變化較大，但FAM134B是否通過調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)特別是ARFRP1的表達(dá)來影響脂肪聚酯，暫不明確。為探究在豬脂肪細(xì)胞上ARFRP1對FAM134B表達(dá)以及對豬脂肪細(xì)胞聚酯分化的影響，本實驗通過設(shè)計ARFRP1干擾載體來研究ARFRP1在豬脂肪細(xì)胞分化過程中的作用。實驗

11、結(jié)果表明:干擾豬脂肪細(xì)胞中的ARFRP1后，與對照組相比FAM134B表達(dá)量沒有顯著變化，但細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量顯著降低(p＜0.05)，脂肪分化關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPα以及脂肪合成關(guān)鍵基因FAS的mRNA表達(dá)量明顯下降(p＜0.05)，脂肪沉積減少。進(jìn)一步通過共轉(zhuǎn)染ARFRP1干擾質(zhì)粒與FAM134B超表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)脂肪細(xì)胞，檢測脂肪沉積情況。油紅O染色及甘油三酯含量檢測結(jié)果都顯示，共轉(zhuǎn)染組脂肪沉積量顯著高于ARFRP1干擾組(p＜