FAM3A基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析及其在脂肪生成中的作用研究.pdf

1、FAM3A是蛋白質(zhì)序列相似度為3的細胞因子家族成員之一，它在肝臟中受到PPARG調(diào)控，參與脂肪代謝。本實驗旨在研究FAM3A在前體脂肪細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及其在脂肪細胞分化過程中的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.在3T3L1細胞中過表達C/EBPbeta，檢測FAM3A基因表達量變化，發(fā)現(xiàn)C/EBPbeta能促進FAM3A表達(P＜0.01)。
　　2.構(gòu)建FAM3A啟動子缺失雙熒光報告載體D1（-1478/+46）、

2、D2(-1187/+46)、D3(-951/+46)、D4(-442/+46)、D5(-285/+46)和D6(-32/+46)，分別轉(zhuǎn)染3T3L1、C2C12和CHO三種細胞，檢測熒光活性，結(jié)果FAM3A啟動子各缺失在三種細胞中都有活性且有相似活性趨勢，D5(-285/+46)活性最高，D6(-32/+46)活性最低，只有基本啟動子活性。由此推斷核心啟動子位于-32bp至+46bp區(qū)域，-285bp至-32bp區(qū)域是啟動子正向調(diào)控元件

3、富集區(qū)，而-1478bp至-285bp區(qū)域分布著較多的抑制啟動子活性的元件。
　　3.將C/EBPbeta真核表達載體與FAM3A啟動子各缺失共轉(zhuǎn)染，F(xiàn)AM3A啟動子各缺失活性顯著增強(P＜0.01)，其中C/EBPbeta對缺失片斷D-1187/+46的作用最顯著(P＜0.01)，將D-1187/+46活性提高了3.55倍。繼續(xù)將啟動子上C/EBPbeta結(jié)合位點定點突變并與C/EBPbeta真核表達載體共轉(zhuǎn)染3T3L1細胞，結(jié)

4、果突變啟動子活性幾乎不受C/EBPbeta影響。接著應(yīng)用EMSA實驗進一步證明C/EBPbeta蛋白能與啟動子上C/EBPbeta結(jié)合位點結(jié)合。
　　4.構(gòu)建FAM3A真核表達載體并轉(zhuǎn)染3T3L1細胞，用MDI誘導(dǎo)3T3L1細胞分化，結(jié)果該細胞成脂分化效率受到FAM3A抑制，分化8天后甘油三脂含量顯著降低。檢測脂肪分化標志基因表達情況，發(fā)現(xiàn)同對照組相比，PPARG2和FABP4在FAM3A基因在細胞分化2天后表達量顯著下調(diào)(P＜0

5、.05)，C/EBPα、SCD1、DGAT1、LPL和FABP4基因在分化8天后下調(diào)表達，并達到顯著水平(P＜0.05)。FAM3A基因在3T3L1細胞分化8天后對HSL、ACC2、AdipoR1、FAS、ACOX1和UCP2基因表達沒有影響。
　　5.將FAM3A真核表達載體轉(zhuǎn)染3T3L1細胞，72小時后收集細胞測定細胞周期，結(jié)果實驗組的G1期細胞數(shù)量從63.5％上升到72.7％，同時S期占的細胞比例從24.8％下降至18.3％