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文檔簡(jiǎn)介
1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)是對(duì)蝦重要的致病原,從開(kāi)始發(fā)病的2到5天內(nèi)會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦100%的死亡率。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在靶定細(xì)胞、病毒入侵、組裝、復(fù)制和引起宿主抗病毒反應(yīng)的過(guò)程中起重要作用,因此分析病毒蛋白的功能對(duì)于了解WSSV的侵染機(jī)制和致病機(jī)理,尋找有效防止WSSV的感染方法具有重要作用。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
第一部分:VP12是囊膜蛋白,對(duì)應(yīng)中國(guó)株ORF432,編碼102氨基酸,理論分子量為12kDa。根據(jù)Gen
2、eBank上WSSV囊膜蛋白基因vp12(wsv432)的序列,設(shè)計(jì)并合成引物,PCR擴(kuò)增得到vp12基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA–vp12并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞?;蚬こ叹暝?7℃用L-阿拉伯糖誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot和SDS-PAGE檢測(cè)顯示有與預(yù)期大小19kDa相符合的目的蛋白。以Co2+親和層析方法,獲得純化VP12蛋白,制備兔抗VP12的抗體。
提取感染W(wǎng)SSV不同時(shí)刻的對(duì)
3、蝦鰓組織的RNA,利用RT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)VP12是感染早期表達(dá)的基因。用FITC標(biāo)記的VP12與對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞作用,結(jié)果表明VP12能夠粘附到細(xì)胞表面。
用地高辛標(biāo)記VP12,采用Far-western blot、ELISA,分析VP12與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白的作用,結(jié)果表明,VP12與囊膜蛋白 VP24、VP26具有相互作用;分析VP12與對(duì)蝦鰓細(xì)胞膜蛋白的作用,篩選出一個(gè)鰓膜蛋白與VP12具有結(jié)合作用,經(jīng)質(zhì)譜分析為腺嘌呤
4、核苷轉(zhuǎn)移酶(LvANT).
第二部分:用已有的重組菌株,37℃用L-阿拉伯糖誘導(dǎo),以Co2+親和層析方法,獲得純化LvANT蛋白,制備兔抗LvANT的抗體。
Far-western blot、ELISA分析表明重組的VP12和LvANT具有結(jié)合作用。間接免疫熒光結(jié)果表明 VP12與LvANT共定位于細(xì)胞表面; RT-PCR分析表明, LvANT在對(duì)蝦血淋巴、鰓組織、肌肉、類淋巴、肝胰腺、胃、腸組織中都有表達(dá);細(xì)胞定位
5、實(shí)驗(yàn)表明LvANT主要定位在血細(xì)胞的表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi);體外中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LvANT在感染的早期能夠延遲WSSV的侵染。
第三部分:根據(jù)GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp14的序列,設(shè)計(jì)并合成引物,PCR擴(kuò)增得到vp14基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA–vp14并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot和SDS-PAGE檢測(cè)顯示有與預(yù)期大小15k
6、Da相符合的目的蛋白。以Co2+親和層析方法,獲得純化VP14蛋白,制備鼠抗VP14的抗體。
間接免疫熒光試驗(yàn)表明VP14能夠粘附到對(duì)蝦血細(xì)胞表面。質(zhì)譜分析顯示VP14與VP26,VP28有結(jié)合作用;采用Far-western blot證明 VP14與VP26、VP28C、VP37和VP39具有結(jié)合作用。將VP14與對(duì)蝦鰓細(xì)胞膜蛋白作用,篩選出一個(gè)鰓膜蛋白,經(jīng)質(zhì)譜分析為精氨酸激酶(LvAK)。
第四部分:根據(jù)Gene
7、Bank上WSSV囊膜蛋白基因LvAK序列,設(shè)計(jì)并合成引物,PCR擴(kuò)增得到LvAK基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA–AK并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞?;蚬こ叹暝?7℃用L-阿拉伯糖誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot和SDS-PAGE檢測(cè)顯示有與預(yù)期大小45kDa相符合的目的蛋白。以Co2+親和層析方法,獲得純化LvAK蛋白,制備兔抗LvAK的抗體。
Far-western blot、ELISA進(jìn)一步表
8、明重組的LvAK和VP14具有結(jié)合作用,間接免疫熒光結(jié)果表明VP14與LvAK共定位于細(xì)胞表面;轉(zhuǎn)錄分析表明,LvAK在對(duì)蝦血淋巴、鰓組織、肌肉、類淋巴、肝胰腺和腸中都有分布,在肌肉中的表達(dá)量最大;細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明 LvAK主要定位在血細(xì)胞的表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒(méi)有;Real-time PCR分析表明,當(dāng)對(duì)蝦受到WSSV攻擊時(shí),血淋巴、肌肉中的LvAK的表達(dá)量會(huì)迅速發(fā)生變化,表明LvAK與WSSV感染密切相關(guān)。
第五部
9、分:根據(jù)GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp51的序列,設(shè)計(jì)并合成引物,PCR擴(kuò)增得到vp51基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA–vp51并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞?;蚬こ叹暝?7℃用L-阿拉伯糖誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot和SDS-PAGE檢測(cè)顯示有與預(yù)期大小55kDa相符合的目的蛋白。以Co2+親和層析方法,獲得純化VP51蛋白。Far-western blot實(shí)驗(yàn)表明VP51與對(duì)蝦鰓膜蛋白的L
10、vANT、LvRPL7有作用。
第六部分:根據(jù)GeneBank上公布的LvRPL7的序列,設(shè)計(jì)并合成引物,PCR擴(kuò)增得到 LvRPL7基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體 pBAD/gIIIA–RPL7并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞?;蚬こ叹暝?7℃用 L-阿拉伯糖誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot和SDS-PAGE檢測(cè)顯示有與預(yù)期大小37kDa相符合的目的蛋白。以Co2+親和層析方法,獲得純化LvRPL7蛋白,制備兔抗LvR
11、PL7的抗體。
Far-western blot、ELISA分析進(jìn)一步表明重組的LvRPL7和VP51具有結(jié)合作用。RT-PCR分析顯示,LvRPL7的mRNA在對(duì)蝦血淋巴、鰓組織、肌肉、類淋巴、肝胰腺和腸中都有轉(zhuǎn)錄表達(dá),在肌肉中的表達(dá)量最大,其次是鰓組織;細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明 LvRPL7主要定位在血細(xì)胞的表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒(méi)有;Real-time PCR分析表明,當(dāng)對(duì)蝦受到WSSV攻擊時(shí),肌肉和肝胰腺中的LvRPL7
12、的表達(dá)量會(huì)迅速發(fā)生變化,表明LvRPL7與WSSV感染密切相關(guān)。
第七部分:VP136是WSSV核衣殼蛋白, VP136C是VP136 C-端含RGD序列的部分片斷,編碼373個(gè)氨基酸,理論分子量為40KD。根據(jù)GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp136C的序列,設(shè)計(jì)并合成引物,PCR擴(kuò)增得到vp136C基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體pBAD/gIIIA–vp136C并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞?;蚬こ叹暝?7℃用L-
13、阿拉伯糖誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blot和SDS-PAGE檢測(cè)顯示有與預(yù)期大小45kDa相符合的目的蛋白。以 Co2+親和層析方法,獲得純化VP136C蛋白。
用FITC標(biāo)記的VP136C與對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞作用,VP136C能夠粘附到細(xì)胞表面。采用Far-western blot、ELISA方法,分析VP136C與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白的作用,結(jié)果表明,VP136C與囊膜蛋白VP26具有相互作用;分析VP136C與對(duì)蝦鰓細(xì)胞膜
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