對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白基因vp26和vp28的克隆及在畢赤酵母中的表達.pdf

1、對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是全球對蝦的主要病原之一,對全球對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的損失。目前在分子水平WSSV的感染和致病機理還未闡明,結構和功能基因的分析以及致病機理研究是目前WSSV研究的熱點。WSSV是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒,VP26和VP28是它的兩個主要的囊膜蛋白,其中VP28已被初步證明在病毒吸附與入侵中起著關鍵作用,VP26研究較少,但它和VP28是同源蛋白。本研

2、究成功實現了vp26和vp28基因在畢赤酵母中的分泌表達,為以后制備特異性抗體,開展WSSV的快速有效檢測和WSSV亞單位疫苗的研制奠定了基礎,同時為探索外源基因的真核表達積累了經驗。
　　 ⑴vp26、vp28基因的克隆:根據GenBank庫中對蝦白斑病毒的全基因組序列,分別設計擴增該病毒主要結構蛋白基因vp26、vp28的相應引物,以從發(fā)病的斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)中提取的總DNA為模板,利用PCR技術對目

3、的基因進行了擴增,獲得長度均為615bp的2個基因片段,片段大小與預期一致。將目的片段與pGEM-T-easy載體連接,導入大腸桿菌DH5α,獲得陽性重組子pT-vp26、pT-vp28。目的片段測序結果與GenBank庫中公布的vp26、vp28基因序列同源性達到了99％以上,說明已成功獲得vp26和vp28基因片段,且基因在進化上非常保守。
　　 ⑵重組蛋白在畢赤酵母中的分泌表達及表達產物的免疫活性:將vp26、vp28克隆

4、至畢赤酵母穿梭表達質粒pPIC9K,構建重組表達載體pPIC9K-VP26、pPIC9K-VP28,經BglⅡ線性化酶切,電穿孔將其整合到畢赤酵母宿主菌GS115。重組畢赤酵母經PCR鑒定和G418篩選后進行甲醇誘導表達。表達產物分別進行SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析,結果表明:所得到的vp26和vp28基因都能夠進行分泌表達,表達產物大小均為31kDa左右;Westernblot和ELISA結果表明鼠抗血清