核黃素與生長(zhǎng)素對(duì)煙草系統(tǒng)性獲得抗性的調(diào)控作用.pdf

1、核黃素通過(guò)生物合成與代謝途徑上的多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗病防衛(wèi)反應(yīng)，特別是對(duì)植物系統(tǒng)性獲得抗性(systemacquiredrestance，SAR)發(fā)生調(diào)控作用。生長(zhǎng)素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同過(guò)程，通過(guò)抑制SAR抑制植物對(duì)病原物的抗性。本博士論文通過(guò)三項(xiàng)研究，試驗(yàn)解析核黃素與生長(zhǎng)素對(duì)SAR調(diào)控呈現(xiàn)相反作用的分子機(jī)理。首先，把水稻(Oryzasativa)中催化核黃素合成反應(yīng)過(guò)程最后一步的核黃素合酶(riboflavinsyntha

2、se，RS)與倒數(shù)第二步的2，4-二氧四氫喋啶合酶(lumazinesynthase，LS)引入煙草(Nicotianatobacum)，它們?cè)跓煵葜挟愒幢磉_(dá)以后，導(dǎo)致核黃素含量升高，煙草生長(zhǎng)加快，抗病性增強(qiáng)。其次，通過(guò)對(duì)煙草體細(xì)胞無(wú)性系變異產(chǎn)生的組成性表達(dá)SAR的煙草突變體ces1-1的研究，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素和生長(zhǎng)素抑制蛋白NtAPR1對(duì)調(diào)控?zé)煵莸纳L(zhǎng)和防衛(wèi)都起重要作用。然后，通過(guò)T-DNA插入，產(chǎn)生了煙草突變體121-3，鑒定結(jié)果顯示其生

3、長(zhǎng)性狀不變，但抗病性增強(qiáng)，說(shuō)明調(diào)控抗病性的某個(gè)基因受到了影響。這些研究結(jié)果初步解析了核黃素與生長(zhǎng)素交叉調(diào)控植物生長(zhǎng)與抗病防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制，下面分別加以簡(jiǎn)介。
　　1.煙草表達(dá)水稻RS基因?qū)ιL(zhǎng)與抗病性的影響
　　核黃素合酶(RS)催化核黃素合成過(guò)程的最后一步，對(duì)核黃素合成起決定性的作用。細(xì)菌和酵母很多的RS基因得到克隆，植物上研究甚少。本實(shí)驗(yàn)室克隆的水稻RS基因，與其他一些生物中已克隆到的RS基因在核苷酸序列和氨基酸序列上都沒(méi)

4、有同源性。為了深入了解在植物體內(nèi)RS所發(fā)揮的功能，我們將水稻的RS基因在煙草體內(nèi)異源表達(dá)，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草(RSETT)，表達(dá)RS的轉(zhuǎn)基因煙草(RSETT)生長(zhǎng)加快，生長(zhǎng)相關(guān)基因NtEXP1、NtEXP2表達(dá)水平升高，對(duì)TMV的抗性增強(qiáng)?？共》佬l(wèi)相關(guān)基因PR-1a、PR-1b的檢測(cè)結(jié)果顯示，在RSETT中PR-1a，PR-1b的表達(dá)顯著增強(qiáng)，與其抗病表型相一致。接種TMV于不同時(shí)間點(diǎn)取煙草葉片檢測(cè)其活性氧，結(jié)果顯示隨時(shí)間增加WT煙草活性

5、氧產(chǎn)生量大于RSETT煙草，表明水稻RS削弱了煙草積累活性氧(ROS)的能力，檢測(cè)過(guò)敏性細(xì)胞死亡(PCD)標(biāo)志性基因hin1和hsr203，與野生型煙草中的表達(dá)量相比，二者在轉(zhuǎn)基因的煙草中表達(dá)較弱。另外，測(cè)定了RSETT內(nèi)源黃素(Flavins)(游離態(tài)核黃素、FMN和FAD)含量，以及乙烯（ET)的釋放量，其產(chǎn)量均高于WT植株。同時(shí)，檢測(cè)乙烯信號(hào)通路中的相關(guān)基因ETR1，CTR1，ERF1，結(jié)果，RSETT的乙烯信號(hào)增強(qiáng)。
　　

6、2.煙草表達(dá)水稻LS基因?qū)ιL(zhǎng)與SAR的影響
　　2，4-二氧四氫喋啶合酶(LS)是生物體內(nèi)合成核黃素的關(guān)鍵催化酶，催化合成途徑倒數(shù)第二步反應(yīng)，決定著生物體內(nèi)的核黃素的含量。核黃素是一種多功能性的維生素，對(duì)動(dòng)植物、微生物的生長(zhǎng)發(fā)育以及抗病防衛(wèi)反應(yīng)都具有很重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室從水稻中克隆到的LS基因，與高等植物的LS基因同源性較高。研究將水稻LS基因轉(zhuǎn)入煙草，獲得異源表達(dá)LS的轉(zhuǎn)基因煙草(LSETT)。同野生型煙草(WT)相比，LS

7、ETT生長(zhǎng)加快，相關(guān)基因NtEXP1、NtEXP2表達(dá)量升高，對(duì)煙草花葉病毒病(tobaccomosaicvirus,TMV)、空莖病菌(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovor，Pcc)及煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)的抗性增強(qiáng)，抗病防衛(wèi)相關(guān)基因PR-1a、PR-1b、NPR1和GST1的表達(dá)均顯著增強(qiáng)。使用DAB染色的方法檢測(cè)煙草葉片中的

8、活性氧，隨時(shí)間增長(zhǎng)，LSETT體內(nèi)活性氧積累量低于WT。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中細(xì)胞死亡情況，發(fā)現(xiàn)LSEST與WT無(wú)差異，PCD標(biāo)志基因hin1和hsr203表達(dá)與其表型一致。測(cè)定LSETT和WT中黃素(游離態(tài)核黃素、FMN和FAD)含量，結(jié)果顯示核黃素含量在轉(zhuǎn)基因煙草中顯著升高。此外，為了研究水稻LS如何參與調(diào)控?zé)煵菘共⌒裕约巴ㄟ^(guò)何種信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，我們測(cè)定乙烯、茉莉酸（JA）含量，發(fā)現(xiàn)LSETT體內(nèi)乙烯、茉莉酸含量顯著高于野生型。進(jìn)一步檢測(cè)

9、了乙烯、茉莉信號(hào)傳導(dǎo)通路五個(gè)關(guān)鍵性標(biāo)志基因的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草的這兩個(gè)信號(hào)表現(xiàn)增強(qiáng)。
　　3.生長(zhǎng)素對(duì)煙草SAR的調(diào)控作用
　　生長(zhǎng)素(Auxin)在植物的整個(gè)生命周期中自始至終發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，生長(zhǎng)素信號(hào)通路與其它植物激素通路相交叉，以確保植物體正常的生長(zhǎng)發(fā)育。為了研究生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)與SAR的交叉調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)野生型煙草進(jìn)行體細(xì)胞無(wú)性系變異處理，得到了組成性表達(dá)系統(tǒng)性獲得抗性的煙草突變體ces1-1。本研究對(duì)此

10、煙草突變體進(jìn)行深入研究，ces1-1表現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢植株矮化，不能表達(dá)與生長(zhǎng)途徑相關(guān)的NtEXP1和NtEXP2基因，而對(duì)病原菌的抗性增強(qiáng)，防衛(wèi)反應(yīng)基因PR-1a，Chia5，hin1和hsr203組成性表達(dá)。突變體ces1-1與野生型WT煙草的RNA差異顯示分析，相差一個(gè)與編碼生長(zhǎng)素抑制蛋白的基因(NtARP1)一致的轉(zhuǎn)錄本，WT中該基因不轉(zhuǎn)錄。利用cDNA末端快速擴(kuò)增的方法克隆到ces1-1中的NtARP1基因，生長(zhǎng)素處理，ces1-1

11、的NtARP1表達(dá)和蛋白產(chǎn)生受到抑制，亞細(xì)胞定位檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NtARP1定位于突變體ces1-1的細(xì)胞核上。利用病毒介導(dǎo)的RNAi的方法將NtARP1沉默，ces1-1生長(zhǎng)和抗病防衛(wèi)反應(yīng)表型特征均恢復(fù)到野生型水平，表明NtARP1在調(diào)控?zé)煵莸纳L(zhǎng)防衛(wèi)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。檢測(cè)ces1-1內(nèi)源生長(zhǎng)素含量，發(fā)現(xiàn)其含量低于野生型，外部施用生長(zhǎng)素，則含量恢復(fù)到野生型水平，并且可以使ces1-1無(wú)論生長(zhǎng)表型，還是組成性SAR的表型均恢復(fù)到野生型狀態(tài)

12、。這些結(jié)果表明，生長(zhǎng)素既影響植物生長(zhǎng)，也影響抗病防衛(wèi)反應(yīng)能力，應(yīng)該存在一個(gè)生長(zhǎng)素的信號(hào)通路，對(duì)于調(diào)控植物生長(zhǎng)和調(diào)控植物防衛(wèi)呈現(xiàn)拮抗效果。
　　4.煙草抗病性突變體121-3的特性與突變基因分析
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入植物基因組產(chǎn)生突變體的技術(shù)，對(duì)于突變體研究以及基因功能鑒定極為有效，這種技術(shù)在擬南芥、煙草、水稻等植物研究中得到了廣泛應(yīng)用，并建立起許多T-DNA標(biāo)簽插入突變體庫(kù)。本研究對(duì)使用T-DNA插入獲得的表現(xiàn)組成性

13、SAR的煙草突變體121-3及其突變基因NtTIA進(jìn)行分析研究。突變體121-3表現(xiàn)表型無(wú)變異，抗病性顯著增強(qiáng)?？梢?jiàn)，T-DNA的插入改變了煙草體內(nèi)與抗病相關(guān)的基因表達(dá)，激活了抗病防衛(wèi)反應(yīng)。通過(guò)熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)，得到T-DNA的右邊界（RB）旁側(cè)植物基因組DNA序列(281bp)，初步確定了T-DNA在煙草基因組中的插入位置。該DNA序列在突變體中被激活表達(dá)，斷定其是與突變體抗病性改變相關(guān)的功能片段，我們將這段序列

14、命名為NtTIA。為得到NtTIA完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法擴(kuò)增NtTIA的3'端和5'端的表達(dá)序列，結(jié)果在其3'端最終得到1230bp的片段，是煙草基因組序列，而5'端擴(kuò)增到的則是載體上T-DNA區(qū)域的序列，這與T-DNA插入原理是一致的。對(duì)NtTIA對(duì)于煙草抗病性調(diào)控作用進(jìn)行研究，NtTIA在121-3突變體中組成性轉(zhuǎn)錄表達(dá)。病原菌侵染誘導(dǎo)NtTIA表達(dá)增強(qiáng)，可見(jiàn)，NtTIA與突變體抗病性密

15、切相關(guān)。而它是通過(guò)何種途徑來(lái)調(diào)控?zé)煵菘共⌒?，與哪種信號(hào)通路相關(guān)？我們對(duì)其施用激素SA、JA、ET、IAA和ABA分別處理，發(fā)現(xiàn)在野生型煙草中NtTIA依然沒(méi)有轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在121-3突變體中，SA誘導(dǎo)NtTIA表達(dá)減弱，JA誘導(dǎo)NtTIA表達(dá)增強(qiáng)，推斷NtTIA可能參與SA和JA信號(hào)傳導(dǎo)通路中的抗病防衛(wèi)機(jī)制，有待于進(jìn)一步的研究。
　　結(jié)論
　　第一，水稻RS在煙草體內(nèi)異源表達(dá)后，影響乙烯與ROS信號(hào)傳導(dǎo)，交叉調(diào)控?zé)煵萆L(zhǎng)與抗