不同果實(shí)特異性啟動(dòng)子調(diào)控下的IGF-1基因?qū)Ψ堰z傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是茄科（Solanaceae），番茄屬的植物，是原產(chǎn)自南美亞熱帶地區(qū)，一年生植物，是世界各地廣泛種植的一種重要蔬菜作物之一。在番茄上開(kāi)展表達(dá)口服疫苗的研究，可大大提升番茄的應(yīng)用價(jià)值。不同類型的果實(shí)特異性啟動(dòng)子在果實(shí)中的發(fā)育時(shí)期及調(diào)控機(jī)理不同，篩選理想的果實(shí)特異性啟動(dòng)子可為利用番茄作為載體來(lái)表達(dá)外源蛋白奠定前期基礎(chǔ)。IGF-1是調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、免疫和機(jī)體代謝的關(guān)鍵因

2、子，在治療糖尿病、骨質(zhì)疏松、肌營(yíng)養(yǎng)不良性側(cè)索硬化病等疾病具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以番茄為材料，構(gòu)建了包含不同果實(shí)特異性的5個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將IGF-1基因?qū)敕阎?，并進(jìn)行了分子檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)基因番茄植株，為利用番茄特異表達(dá)外源蛋白提供技術(shù)和理論基礎(chǔ)，也為利用番茄口服治療糖尿病奠定材料基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　（1）表達(dá)載體的構(gòu)建：本研究構(gòu)建了5個(gè)果實(shí)特異性啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體：pCAP-IGF-1、pC

3、APG-IGF-1、pCAGP-IGF-1、pCATP-IGF-1和pCAOC-IGF-1。并將5個(gè)植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。
　　（2）番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化：試驗(yàn)采用AC++和1448兩種番茄材料，分別進(jìn)行再生體系的培養(yǎng)，結(jié)果表明：番茄材料 AC++誘導(dǎo)分化的效果明顯高于1448，進(jìn)而確立了最佳再生體系培養(yǎng)的材料為番茄材料AC++。采用正交設(shè)計(jì)法，研究了不同的激素水平（IAA、ZT、AgNO3)對(duì)番茄再生體系

4、的影響。確定了誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽分化的最適宜培養(yǎng)基為：MS+ ZT2.0mg/L+ IAA0.5mg/L+AgNO33.0mg/l；誘導(dǎo)生根的最適宜培養(yǎng)基為：1/2 MS+IAA0.3mg/L。采用正交設(shè)計(jì)法，對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的各參數(shù)（浸染液、乙酰丁香酮、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)天數(shù)）進(jìn)行優(yōu)化,確定了最適宜的轉(zhuǎn)化參數(shù)：以浸染液為 MS的液體培養(yǎng)基，不添加乙酰丁香酮、浸染時(shí)間10 min、共培養(yǎng)天數(shù)2d為最佳轉(zhuǎn)化條件。
　?。?）抗性植株的

5、PCR鑒定：經(jīng)轉(zhuǎn)化體系的培養(yǎng)，最終獲得抗性苗共41株，其中AGPL1啟動(dòng)子獲得抗性植株15株，黃瓜素啟動(dòng)子獲得抗性植株12株，甜瓜ACO啟動(dòng)子獲得抗性植株6株，PG啟動(dòng)子獲得抗性植株6株，AP啟動(dòng)子獲得2株抗性植株。對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，共21株陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率達(dá)51.21％。證明外源基因IGF-1已成功整合進(jìn)入番茄基因組中。其中AGPL1啟動(dòng)子最終獲得陽(yáng)性植株8株，黃瓜素啟動(dòng)子獲得陽(yáng)性植株6株，甜瓜ACO啟動(dòng)子獲得陽(yáng)性植