大豆疫霉無(wú)毒基因PsAvr5和PsAvrlc的克隆及PsAvr3c的多態(tài)性研究.pdf

1、大豆是世界范圍的一種重要的糧食、工業(yè)和能源作物。由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的大豆莖腐和根腐病是最具有破壞性的大豆病害之一。根據(jù)“基因?qū)颉睂W(xué)說(shuō)，大豆-大豆疫霉菌這一病理體系中的抗病基因和相應(yīng)的無(wú)毒基因符合基因與基因互作。目前，利用抗病基因培育抗病品種是防治大豆疫病的主要途徑。因此，在分子水平上闡述大豆疫霉無(wú)毒基因和大豆抗病基因的互作機(jī)理有助于理解病害發(fā)生的機(jī)制，從而為大豆的育種及大豆疫病的控制提供理論依據(jù)

2、。本研究結(jié)合遺傳作圖、大豆疫霉全基因組預(yù)測(cè)的RXLR效應(yīng)蛋白數(shù)據(jù)和大豆疫霉菌株的單體型分析推斷PsAvr5和PsAvr3a是等位基因，并運(yùn)用植物基因槍瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)和大豆疫霉穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)證實(shí)PsAvr5和PsAvr3a是等位基因，從而克隆出大豆疫霉無(wú)毒基因PsAvr5;大豆疫霉菌株ACR10和P7076雜交后代的毒性特征的遺傳分析表明大豆疫霉無(wú)毒基因PsAvr1c是一個(gè)單顯性基因，對(duì)其候選基因進(jìn)行了檢測(cè)，并運(yùn)用分離群體分組分析法篩選到

3、3個(gè)與其相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，推斷該基因定位于基因組中3個(gè)位點(diǎn)所在的一段94 Kb的區(qū)域內(nèi)，從而為該無(wú)毒基因的克隆奠定了基礎(chǔ);初步研究了中國(guó)大豆疫霉群體中無(wú)毒基因Avr3c的多態(tài)性，為揭示大豆疫霉菌的毒性變異機(jī)制提供了分子理論依據(jù)。
　　 大豆疫霉是一種植物病原卵菌，它可以引起大豆的根腐和莖腐病。大豆疫霉無(wú)毒基因（Avr）的編碼產(chǎn)物被大豆抗病基因（Rps）的編碼產(chǎn)物識(shí)別后會(huì)激發(fā)大豆產(chǎn)生抗病反應(yīng)。以前的研究表明PsAvr5和P

4、sAvr3a遺傳連鎖。遺傳作圖、大豆疫霉全基因組預(yù)測(cè)的RXLR效應(yīng)蛋白數(shù)據(jù)和大豆疫霉菌株的單體型分析推斷PsAvr5和PsAvr3a是等位基因。運(yùn)用植物基因槍瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)和大豆疫霉穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行功能驗(yàn)證。植物基因槍瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)顯示PsAvr3a P6497可以在含有Rps5的大豆鑒別寄主上引起特異的細(xì)胞壞死，而PsAvr3aACR12和PsAvr3aP7064卻不能。這證明了PsAvr5和PsAvr3a是等位基因，PsAvr3aP

5、649是PsAvr5的無(wú)毒等位基因而PsAvr3aACR12和PsAvr3aP7064卻不是。利用大豆疫霉穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，在毒性菌株P(guān)7074中過(guò)量表達(dá)外源的PsAvr3aP6497基因從而得到在含有Rps3a和Rps5的大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無(wú)毒性狀的轉(zhuǎn)化子菌株，以及在無(wú)毒菌株P(guān)6497中沉默PsAvr3aP6497基因從而得到在含有Rps3a和Rps5的大豆鑒別寄主上不再表現(xiàn)為無(wú)毒性狀的轉(zhuǎn)化子菌株，從而進(jìn)一步證明PsAvr3aP64

6、97可以與Rps5互作，即是PsAvr5的無(wú)毒等位基因。序列分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)關(guān)鍵氨基酸的差異決定是否受到Rps3a或Rps5的識(shí)別。
　　 為了克隆大豆疫霉無(wú)毒基因PsAvr1c，構(gòu)建了大豆疫霉菌株ACR10和P7076的雜交群體。ACR10在Rps1c大豆鑒別寄主(L75-3735)上表現(xiàn)為無(wú)毒而P7076表現(xiàn)為毒性。在25個(gè)雜合的F1后代中，12個(gè)F1后代在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無(wú)毒，一個(gè)F1后代在Rps1c大豆鑒別寄主

7、上表現(xiàn)為毒性，而其余12個(gè)F1后代失去了基本致病性或者重復(fù)測(cè)定的毒力表型不一致。一個(gè)在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無(wú)毒的F1后代(F1-62)自交產(chǎn)生了40個(gè)F2后代。其中22個(gè)F2后代在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無(wú)毒，6個(gè)F2后代在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為毒性，其余的失去了基本致病性或者重復(fù)測(cè)定的毒力表型不一致。卡方分析顯示F2后代在Rps1c大豆鑒別寄主上的毒力性狀的分離比例符合無(wú)毒∶毒性為3∶1的假設(shè)(P＞0.05)。

8、因此，推斷控制大豆疫霉親本菌株對(duì)Rps1c大豆鑒別寄主的無(wú)毒性狀的PsAvr1c基因是一個(gè)單顯性基因。通過(guò)比較基因組學(xué)分析了4個(gè)菌株R2(P6497)、R7(P7064)、R17(P7074)和R19(P7076)的全基因組序列，篩選到75個(gè)具有序列多態(tài)性特征，且這種序列多態(tài)性特征與4個(gè)菌株在Rps1c大豆鑒別寄主上的毒力表型是一致的編碼RXLR motif的基因。將這些基因作為PsAvr1c的候選基因。CAPs鑒定發(fā)現(xiàn)其中20個(gè)Avh

9、基因不是PsAvr1c，并且這20個(gè)CAPs標(biāo)記也不與PsAvr1c位點(diǎn)連鎖。檢測(cè)了46個(gè)大豆疫霉Avh基因在親本菌株ACR10和P7076中的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)PsAvh111具有轉(zhuǎn)錄多態(tài)性的特征，在無(wú)毒菌株ACR10中可以表達(dá)而在毒性菌株P(guān)7076中卻不表達(dá)。但其在檢測(cè)的無(wú)毒和毒性F2后代中卻不存在明顯的轉(zhuǎn)錄多態(tài)性特征，因此PsAvh111也不是PsAvr1c。采用分離群體分組分析法構(gòu)建了一個(gè)無(wú)毒池和一個(gè)毒性池。通過(guò)全基因組測(cè)序篩選到3

10、個(gè)與PsAvr1c位點(diǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，推斷該基因定位于基因組中3個(gè)位點(diǎn)所在的一段94 Kb的區(qū)域內(nèi)，從而為該無(wú)毒基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。
　　 選擇22個(gè)不同地理來(lái)源的中國(guó)大豆疫霉菌株，并提取其基因組DNA。設(shè)計(jì)特異性引物并擴(kuò)增出大豆疫霉無(wú)毒基因Avr3c的全長(zhǎng)及其部分兩端序列，測(cè)序結(jié)果表明Avr3c存在3種核苷酸序列多態(tài)性，分別為Avr3c-1、 Avr3c-2和Avr3c-3。在Rps3c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無(wú)毒的菌

11、株中Avr3c核苷酸序列為類(lèi)型Avr3c-1。在Rps3c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為毒性的菌株:15個(gè)毒性菌株的Avr3c核苷酸序列也為類(lèi)型Avr3c-1;5個(gè)毒性菌株的Avr3c核苷酸序列為類(lèi)型Avr3c-2，它與無(wú)毒菌株中的類(lèi)型Avr3c-1的核苷酸序列相似性為97％;1個(gè)毒性菌株的Avr3c核苷酸序列為類(lèi)型Avr3c-3，它與無(wú)毒菌株中的類(lèi)型Avr3c-1的核苷酸序列相似性為96％。氨基酸序列分析顯示相對(duì)于無(wú)毒菌株中的類(lèi)型Avr3c-1

12、，毒性菌株中的類(lèi)型Avr3c-1的序列和其一樣、類(lèi)型Avr3c-2的14個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變、類(lèi)型Avr3c-3的21個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變且一個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生缺失。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Avr3c在含有類(lèi)型Avr3c-1的2個(gè)毒性菌株中不轉(zhuǎn)錄。全長(zhǎng)序列的非同義突變與同義突變的比值(dN/dS)大于1揭示Avr3c受到了來(lái)自寄主植物抗病基因強(qiáng)大的正向選擇壓力。單氨基酸位點(diǎn)的正向選擇壓力分析鑒定出Avr3c存在21個(gè)發(fā)生正向選擇的氨基酸位點(diǎn)(