游離脂肪酸通過Ca2+-calpain-2途徑誘導β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡的機制研究.pdf

1、β細胞功能損害是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)發(fā)病的主要特征之一。肥胖與T2DM都與升高的游離脂肪酸(Free fatty acids,FFA)水平有關(guān)。但是, FFA造成β細胞功能損害的分子機制尚不清楚。在本實驗中,我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的標志性分子grp78和ERS誘導的凋亡因子CHOP的表達隨著FFA對β細胞作用時間的延長而呈時

2、間依賴性的增加。FFA作用β細胞后,作為觸發(fā)ERS的3個信號分子:ATF6、磷酸化的PERK和磷酸化的IRE1,它們的表達水平也顯著增加。故我們證實了FFA能夠誘導β細胞的ERS。我們同時發(fā)現(xiàn),FFA能夠促進STIM1和Orai1的結(jié)合以增加庫容性的Ca2+內(nèi)流,從而誘導ERS的發(fā)生。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)calpain-2分子參與了FFA誘導的CHOP的表達并誘導了caspase12和caspase3的激活,通過這些分子信號促進了β細胞的

3、凋亡。綜上所述, Ca2+/calpain2通路在調(diào)節(jié)FFA誘導的β細胞ERS和凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。本實驗分為四個部分:
　　第一部分:游離脂肪酸誘發(fā)β-TC3細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡的研究
　　為了檢測FFA是否可以誘導β-TC3細胞的ERS,我們觀察了ERS相關(guān)標志性分子的表達。ERS關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子有分子伴侶Grp78(也被稱為Bip)和轉(zhuǎn)錄因子CHOP。在實驗中,β-TC3細胞用0.5mM的FFA或者牛血清白蛋白(Bo

4、vine serum albumin, BSA)分別處理0、8、16和24小時,然后兩組之間進行對比觀察。結(jié)果顯示,相對于BSA處理過的β-TC3細胞而言,在FFA處理過的細胞中,Grp78和CHOP的mRNA及蛋白表達量均隨著處理時間的延長而增加,呈現(xiàn)出時間依賴性的增長(P<0.05)。
　　為了進一步評估FFA是否能夠誘導β-TC3細胞的ERS,我們檢測了ATF6, PERK和IRE1這3個參與ERS過程的重要信號分子的表達和

5、磷酸化水平。我們觀察到在FFA處理16小時后,β-TC3細胞ATF6、磷酸化的PERK和磷酸化的IRE1的表達與BSA處理組相比均顯著增加(P<0.05)。
　　上述的結(jié)果表明,FFA可以誘導β-TC3細胞的ERS。
　　由于 ERS可能是細胞死亡的一個中間環(huán)節(jié),所以我們用 annexin V/propidium iodide(PI)雙標染色法在FFA處理β-TC3細胞后,檢測了細胞的凋亡程度。結(jié)果顯示, FFA處理過的細胞

6、凋亡水平較BSA處理過的細胞凋亡水平明顯增加(P<0.05)。
　　已知鼠源caspase-12的激活同ERS誘導的細胞凋亡相關(guān)。因此,我們還觀察了β-TC3細胞caspase-12的活性水平。我們發(fā)現(xiàn),在FFA處理過的β細胞中,caspase-12的激活水平與BSA處理組相比顯著增加(P<0.05)。
　　已知,在哺乳動物中,caspase-3(也被稱為CPP32, apopain或者YAMA)被認為是細胞凋亡的一個關(guān)鍵的

7、中間分子。故我們進一步檢測了caspase-3的激活情況。我們觀察到在 FFA處理過的細胞中,caspase-3的激活水平與 BSA處理組相比顯著提高(P<0.05)。
　　從以上所有的結(jié)果可以得出,FFA可以成功地誘導β-TC3細胞的ERS和凋亡。第二部分:庫容性Ca2+內(nèi)流參與游離脂肪酸誘發(fā)β-TC3細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的研究
　　已知打破細胞內(nèi)的Ca2+平衡能夠干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能并誘導細胞 ERS。在例如胰腺β-TC3細胞這樣

8、的非興奮性細胞中,Ca2+內(nèi)流是維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的主要機制。為了檢測在β-TC3細胞中,FFA誘導的ERS是否由Ca2+內(nèi)流變化引起,我們應用了一種Ca2+通道阻滯劑NiCl2來處理細胞。實驗結(jié)果顯示,在加入NiCl2處理細胞后, FFA并不能夠增加Grp78和CHOP的表達水平(P<0.05)。這個結(jié)果能夠說明FFA誘導的β細胞ERS是由Ca2+內(nèi)流調(diào)節(jié)的。
　　已知細胞內(nèi) Ca2+內(nèi)流的一條主要途徑是通過庫容性 Ca2+

9、通道。為了進一步證實在β-TC3細胞中,FFA誘導的ERS是否由庫容性Ca2+內(nèi)流變化引起,在FFA處理過的細胞中,我們檢測了庫容性Ca2+內(nèi)流的情況。實驗結(jié)果顯示,FFA處理過的β-TC3細胞,其庫容性Ca2+內(nèi)流水平是BSA處理組的兩倍有余(P<0.05)。
　　近來的一些研究發(fā)現(xiàn),STIM1和Orai1這兩個分子與庫容性Ca2+內(nèi)流密切相關(guān)。我們通過實驗發(fā)現(xiàn),在FFA處理組和BSA處理組之間,STIM1和Orai1的總表達量

10、相當(P>0.05)。然而,免疫共沉淀結(jié)果顯示,在 FFA處理組中,STIM1和 Orai1的結(jié)合明顯多于在BSA處理組中兩者的結(jié)合(P<0.05)。這些結(jié)果顯示,在β-TC3細胞中,FFA增強了STIM1和Orai1的結(jié)合。
　　因此,上述結(jié)果說明FFA誘導的β細胞ERS是由庫容性Ca2+內(nèi)流的變化引起的,而庫容性Ca2+內(nèi)流是由STIM1和Orai1的結(jié)合調(diào)控的。
　　第三部分:calpain-2參與游離脂肪酸促進β-T

11、C3細胞CHOP表達的研究
　　Calpain-2是一個中性的Ca2+依賴的蛋白酶。它介導了很多的生理性功能,例如細胞骨架重塑,細胞內(nèi)囊泡運輸以及細胞膜融合等。在β-TC3細胞中,為了評估FFA是否影響了calpain-2的活性,我們檢測了FFA處理過的β細胞中calpain-2的活性。結(jié)果顯示,FFA處理過的β-TC3細胞中的calpain-2活性與BSA處理組相比顯著增強(P<0.05)。
　　為了檢測FFA誘導的β-T

12、C3細胞ERS是否與calpain-2分子相關(guān),我們設計了小干涉 RNA(Small interfering RNA,siRNA)來下調(diào) calpain-2的表達?？梢钥吹絚alpain-2的siRNA可以顯著地降低其蛋白和mRNA的表達量(P<0.05)。
　　我們還可以觀察到,當β-TC3細胞接受siRNA處理后,相對于BSA處理過的細胞而言,FFA處理過的細胞中的calpain-2活性并沒有顯著的增加(P>0.05)。

13、>　　為了進一步證實calpain-2是否參與了FFA誘導的ERS,當采用calpain-2 siRNA處理抑制β-TC3細胞的calpain-2活性后,我們檢測了Grp78和CHOP的蛋白和mRNA表達水平。結(jié)果顯示,當采用siRNA處理后,FFA能夠顯著地增加Grp78的蛋白和mRNA表達水平(P<0.05)。然而在相同條件下,FFA卻不能夠增加CHOP的蛋白和mRNA表達水平(P>0.05)。這些結(jié)果表明calpain-2參與了F

14、FA誘導的ERS中CHOP的表達,而與Grp78的表達無關(guān)。
　　第四部分:Calpain-2參與游離脂肪酸誘導β-TC3細胞凋亡的研究
　　前三部分實驗已經(jīng)表明, FFA作用可以增加β-TC3細胞凋亡水平。為了進一步證實calpain-2分子參與了FFA誘導β細胞凋亡的過程,我們使用calpain-2的siRNA處理細胞,并運用Annexin V/PI雙標染色法證實,在下調(diào)β-TC3細胞calpain-2的表達水平后,相對

15、于BSA處理過的細胞而言,FFA處理并不能夠增加凋亡細胞的百分比(P>0.05)。
　　為了確認這些結(jié)果,我們還檢測了calpase-12和caspase-3的活性水平。實驗結(jié)果表明,通過calpain-2的siRNA下調(diào)β-TC3細胞calpain-2的表達水平后,相對于BSA處理過的細胞而言,FFA處理并不能夠增加calpase-12和caspase-3的活性水平(P>0.05)。
　　由以上結(jié)果可以看出,下調(diào)calpa