大豆耐鹽相關(guān)基因GmA3和GmA5的篩選及其功能鑒定.pdf

1、全世界鹽堿地面積已達(dá)95億hm2,約占地球陸地總面積的10％,而且正以每年1.0-1.5百萬(wàn)hm2的速度在增長(zhǎng).中國(guó)約有鹽漬土2.7千萬(wàn)hm2,其中約有6.7百萬(wàn)hm2分布于農(nóng)田之中,占耕地面積的7％左右.此外,許多地區(qū)由于灌溉不當(dāng)、植被的破壞和海水入侵等因素,進(jìn)一步造成相當(dāng)大面積的次生鹽漬化土壤.土壤中含鹽量的增加將影響植物的正常生長(zhǎng),嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致植物的萎蔫甚至死亡.這不僅造成了農(nóng)作物的嚴(yán)重減產(chǎn),也將給生態(tài)環(huán)境造成巨大破壞.科學(xué)家們一

2、方面進(jìn)行土壤改良,改善農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境,另一方面,試圖通過(guò)遺傳育種技術(shù),提高植物對(duì)高鹽的耐受性.該實(shí)驗(yàn)以耐鹽大豆品種的未成熟種子的eDNA文庫(kù)為材料,轉(zhuǎn)化大腸桿菌.結(jié)合高鹽篩選法及PCR鑒定,從大豆eDNA文庫(kù)中篩選出28株重組耐鹽候選菌株.將上述菌株中分離出重組質(zhì)粒,重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌.經(jīng)高鹽篩選后,確定其中的5個(gè)為耐鹽重組菌.挑選其中耐鹽性最強(qiáng)的2個(gè)菌,分別命名為XLOLR/pBK-GmA3和XLOLR/pBK-GmA5進(jìn)行下一步研究.

3、在對(duì)照菌不能生長(zhǎng)的含1100mM NaCl的平板培養(yǎng)基上,重組菌XLOLR/pBK-GmA3生長(zhǎng)良好.在含較高離子濃度1000mM NaCl、700mM KCl、180mM MgCl2的液體培養(yǎng)基中,對(duì)照菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制,而重組菌生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照菌,表現(xiàn)出明顯縮短的遲滯期和較高的生長(zhǎng)量.重組質(zhì)粒pBK-GmA3中插入的大豆eDNA片段含一個(gè)369bp的開(kāi)放閱讀框,編碼122個(gè)氨基酸.其氨基酸序列與擬南芥中HEN4和含KH區(qū)的蛋白

4、質(zhì)的同源性為61％,可以說(shuō)是大豆中的一新基因.大豆GmA3蛋白序列含有一個(gè)KH保守區(qū),此保守區(qū)已在其他生物中已有發(fā)現(xiàn),可能具結(jié)合核酸的特性,并對(duì)細(xì)胞周期有調(diào)控作用.因此推測(cè)大豆GmA3的KH保守區(qū)可能是一個(gè)耐鹽功能區(qū),通過(guò)參與對(duì)重組菌株的其它基因或細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),使重組菌的生長(zhǎng)在高鹽環(huán)境中受到較好的保護(hù)作用,而表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)狀態(tài).重組菌XLOLR/pBK-GmA5在含1100mM NaCl的平板培養(yǎng)基上也能較好的生長(zhǎng).重組質(zhì)粒pBK-

5、GmA5插入的大豆cDNA片段含一個(gè)756bp的開(kāi)放閱讀框,編碼251個(gè)氨基酸.其氨基酸序列與大豆根尖鋁誘導(dǎo)蛋白Sali3-2蛋白質(zhì)序列高度同源,為一已報(bào)道基因,但其功能尚不明確.構(gòu)建高效表達(dá)的亞克隆BL21/pET-GmA5.該亞克隆在不同脅迫條件下800mM NaCl、800mM KCl、220mM MgCl2的生長(zhǎng)曲線,對(duì)照菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制,而重組菌生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照菌,前者表現(xiàn)出明顯縮短的遲滯期和較高的生長(zhǎng)量.大豆GmA5