轉RNA干涉Myostatin基因小鼠成纖維細胞的篩選.pdf

1、肌肉抑制素基因(Myostatin,MSTN)屬TGF-β超家族,是肌肉細胞的自分泌因子,主要在動物骨骼肌中特異性表達并對肌肉的生長發(fā)育起到負調控作用,因此人工敲低MSTN基因表達可以有效促進成肌細胞分化為成熟肌纖維,使得肌肉組織量增加。本研究將干涉MSTN基因的shRNA序列與骨骼肌特異性啟動子相連構建。RNA干涉載體并轉染小鼠皮膚成纖維細胞,通過G418篩選含有neo抗性基因的轉RNA干涉MSTN基因陽性細胞。為進一步通過體細胞核移

2、植獲得敲低MSTN蛋白基因的轉基因鼠奠定基礎。研究結果與結論如下:
　　 1、小鼠肌肉生長抑制素基因的克隆:參照GenBank中序列(BC105674),采用RT-PCR擴增技術,克隆小鼠肌肉生長抑制素基因,將其連接到pcDNA3.1(+)載體,獲得肌肉抑制素基因真核表達載體；
　　 2、RNAi表達載體的構建:參照肌肉抑制素基因的mRNA序列,設計符合“Tuschl”法則的siRNA,并將其以shRNA的序列方式連接到

3、pRNAT-U6干涉載體,獲得RNA干涉表達載體。將上述干涉載體和肌肉抑制素基因真核表達載體共同轉染進293GP細胞中,利用Real-Time PCR儀檢測干涉效率,獲得干涉效率最高的siRNA序列；
　　 3、骨骼肌特異RNA干涉載體的構建:本研究采用人工合成啟動子SP作為特異性啟動子替換RNAi載體中U6啟動子,獲得骼肌特異性啟動的RNA干涉載體。
　　 4、成纖維細胞的轉染與篩選:采用陽離子脂質體法轉染線性化的RN

4、A干涉表達載體于小鼠皮膚成纖維細胞中,利用G418篩選獲得neo基因的抗性細胞;
　　 5、對neo基因抗性細胞的鑒定:對G418篩選獲得的抗性細胞,采用PCR方法鑒定表明所構建的載體整合到細胞基因組中,并對獲得的陽性細胞進行了細胞生物特性檢測。與此同時,將轉基因細胞冷凍后復蘇,再次測定細胞生長曲線。以上結果均顯示細胞曲線符合一般規(guī)律,轉基因及冷凍未對細胞造成嚴重影響。
　　 綜上所述,采用上述方法,獲得轉RNA干涉MS