牦牛、犏牛睪丸組織DEAD-box家族基因表達(dá)、選擇性剪接與啟動子區(qū)甲基化研究.pdf

1、DEAD-box蛋白家族是一個ATP依賴的RNA解旋酶家族，廣泛存在于從原核生物的細(xì)菌到真核生物的酵母、植物和動物等各類生物中，參與多種RNA代謝過程。DDX4、DDX3y和DDX25是DEAD-box家族中與精子發(fā)生相關(guān)的基因，在小鼠、人、牛等很多物種中，DDX4、DDX3y和DDX25的缺失或減少會導(dǎo)致不同形式的精子發(fā)生障礙，精子發(fā)生障礙等生殖缺陷也常伴隨著DDX4、DDX3y和DDX25的缺失或表達(dá)異常。為探究其與精子發(fā)生障礙的關(guān)

2、系，本研究中以犏牛為雄性不育模型，采用real-time PCR技術(shù)檢測了牦牛與犏牛睪丸組織DEAD-box蛋白家族基因（DDX4、DDX3y和DDX25）mRNA表達(dá)水平;采用克隆測序技術(shù)獲得牦牛DDX4基因編碼區(qū)序列，采用生物信息學(xué)方法分析其基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育;采用克隆測序技術(shù)篩選牦牛和犏牛睪丸組織中DDX4基因的選擇性剪接體并采用real-time PCR技術(shù)檢測各剪接體mRNA的表達(dá)水平;采用克隆測序技術(shù)獲得了牦牛和犏牛D

3、DX4基因啟動子區(qū)序列，采用亞硫酸氫鹽測序技術(shù)對牦牛和犏牛睪丸組織中DDX4基因啟動子區(qū)的甲基化程度進(jìn)行比較分析。研究結(jié)果對探討DDX4基因與犏牛雄性不育的關(guān)系，以及揭示犏牛雄性不育的分子機(jī)制均具有一定的意義。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.牦牛和犏牛DDX4、DDX25、DDX3y基因的表達(dá)分析
　　 DDX4和DDX25基因在減數(shù)分裂障礙、雄性不育犏牛睪丸組織中的表達(dá)水平極顯著低于減數(shù)分裂正常的牦牛(P＜0.01)，與

4、人、小鼠等哺乳動物雄性不育個體睪丸組織中DDX4和DDX25基因的表達(dá)模式相同，推測DDX4和DDX25基因在牛精子發(fā)生和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用，且與犏牛雄性不育有一定的關(guān)系。牦牛睪丸組織中DDX3y基因mRNA表達(dá)水平極顯著低于犏牛(P＜0.01)，推測可能是由于DDX3y基因不同轉(zhuǎn)錄本之間的相互作用及轉(zhuǎn)錄本與蛋白之間的反饋調(diào)節(jié)作用造成DDX3y基因mRNA在犏牛睪丸組織中的高表達(dá)。
　　 2.牦牛、犏牛DDX4基因的克隆

5、、序列分析及進(jìn)化研究
　　 牦牛和犏牛DDX4基因編碼區(qū)序列全長均為2190bp，核苷酸序列與其它哺乳動物DDX4基因有較高的同源性，牦牛和犏牛之間一致性為99.95％，僅在編碼區(qū)nt1202處發(fā)現(xiàn)1個堿基轉(zhuǎn)換(T1202C)，并導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的改變(Ile401Thr)。電子染色體定位發(fā)現(xiàn)牛DDX4基因定位于20號染色體上，由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成，起始密碼子位于第二外顯子。哺乳動物DDX4基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示聚類結(jié)果與

6、經(jīng)典分類結(jié)果一致。牦牛和犏牛DDX4基因編碼一個含有729個氨基酸殘基的蛋白，具有DDX4蛋白所有的保守基序（Q、Ⅲ、(V)、GG等）和DEAD-box家族的典型結(jié)構(gòu)域（DEADc、DEXDc），說明牦牛、犏牛DDX4基因與哺乳動物其它物種DDX4基因在進(jìn)化上是相當(dāng)保守的，推測其具有與其它哺乳動物DDX4蛋白類似的生物學(xué)功能，在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　　 3.DDX4選擇性剪接體的克隆及表達(dá)分析
　　 牦牛和犏牛

7、睪丸中發(fā)現(xiàn)DDX4基因的3種轉(zhuǎn)錄本，一種為全長序列DDX4，另兩種為選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本，分別命名DDX4sv1和DDX4sv2。DDX4sv1與正常序列相比缺失完整的第四外顯子(78bp)和部分第五外顯子3’端序列(72bp)共150個堿基，編碼的蛋白缺少50個氨基酸殘基;DDX4sv2與正常序列相比缺失完整的第四外顯子(78bp)，編碼的蛋白缺少26個氨基酸殘基。兩種選擇性剪接體均遵循“GT-AG”的剪接規(guī)則，剪接部位位于核心結(jié)構(gòu)域以外

8、的N末端，編碼的蛋白包含DEAD-box家族蛋白的核心結(jié)構(gòu)域和所有功能基序，推測DDX4sv1和DDX4sv2仍具有DDX4蛋白的基本生物學(xué)功能。
　　 DDX4、DDX4sv1和DDX4sv2三種轉(zhuǎn)錄本在牦牛睪丸組織中的轉(zhuǎn)錄水平為DDX4sv2＞DDX4＞DDX4sv1，差異不顯著;同一轉(zhuǎn)錄本在牦牛和犏牛之間比較發(fā)現(xiàn)，DDX4基因mRNA在犏牛中的表達(dá)水平低于牦牛，差異顯著（0.01＜P＜0.05），DDX4sv1和DDX4s

9、v2基因mRNA在犏牛的表達(dá)水平均極顯著低于牦牛(P＜0.01)。推測DDX4sv1、DDX4sv2的均具有一定生物學(xué)意義，其表達(dá)水平的變化可能會引起精子發(fā)生的異常，并且可能與全長DDX4相互協(xié)調(diào)共同調(diào)控精子發(fā)生過程。
　　 4.牦牛和犏牛DDX4基因啟動子區(qū)甲基化程度分析
　　 通過克隆測序獲得牦牛和犏牛DDX4基因5’側(cè)翼序列1369bp，預(yù)測核心啟動子區(qū)位于-384bp～-134bp（以起始密碼子ATG的A為+1）

10、，長度為251bp，并含有SP1等甲基化敏感位點;預(yù)測CpG島位于-268bp～12bp，長度為345bp，包含20個CpG島。DDX4基因預(yù)測啟動區(qū)在牦牛睪丸組織中的甲基化程度為67.0％(134/200)，犏牛的為86.5％(173/200)，犏牛的甲基化水平極顯著高于牦牛(P＜0.01)，這與犏牛中DDX4基因mRNA的低表達(dá)量一致，各CpG位點的甲基化水平在牦牛與犏牛間無顯著差異。推測DDX4基因啟動子的甲基化可能對其mRNA的