反向重復(fù)TuMV HC-Pro基因轉(zhuǎn)化植物的研究.pdf

1、本研究將反向重復(fù)的蕪菁花葉病毒（TuMV）HC-Pro基因定向插入到植物表達(dá)載體pCambia1301上35S啟動(dòng)子下游,并以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草、擬南芥和雪菜，獲得轉(zhuǎn)基因植物。并對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性進(jìn)行研究。
　　根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的TuMV HC-Pro基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。通過PCR擴(kuò)增獲得部分正反向的HC-Pro基因片段。正向的HC-Pro基因與pGEM-T載體相連，經(jīng)Xba I，Kpn I雙酶切，所得基因片段插到同樣

2、酶切開的載體pCambia1301上；反向的HC-Pro基因連入pMD18-T載體，再用Xba I，Pst I雙酶切切下，連接到已經(jīng)插入正向的HC-Pro基因的pCambia1301載體上。鑒定篩選得到含 TuMV HC-Pro基因的反向重復(fù)植物表達(dá)載體pCambia1301-TuMV HC-Pro。三親交配法將植物表達(dá)載體pCambia1301-TuMV HC-Pro轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株，得到的陽性轉(zhuǎn)化子用于植物轉(zhuǎn)化。

3、>　　用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，將反向重復(fù)TuMV HC-Pro基因轉(zhuǎn)入煙草，潮霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測(cè)陽性率為93.33％。對(duì)部分煙草植株進(jìn)行Southern印跡雜交和RT-PCR，結(jié)果表明TuMV HC-Pro已整合到煙草基因組。接種60株轉(zhuǎn)基因煙草植株，癥狀觀察和ELISA檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TuMV表現(xiàn)出四種不同的抗病性類型：（1）免疫型，整個(gè)植物在生長(zhǎng)過程中無病癥，ELISA反應(yīng)陰性，接種后前五周生長(zhǎng)緩慢，節(jié)間變短

4、，第六周開始正常生長(zhǎng)。（2）抗病型，植物接種后第三周開始發(fā)病，第五周病癥最嚴(yán)重，第七周開始新生的葉子不發(fā)??；節(jié)間極度變短。（3）延遲發(fā)病型，比非轉(zhuǎn)基因植株延遲一周發(fā)病，病癥類似。（4）感病型，與非轉(zhuǎn)基因植株一樣接種后第三周開始發(fā)病，兩者病癥相似。60株轉(zhuǎn)基因植株中免疫型共2株，占3.33%；抗病型共3株，占5%；延遲發(fā)病型，共13株，占21.67%；感病型共42株，占70%。
　　用滴花法和抽真空法將反向重復(fù)TuMV HC-Pro

5、基因轉(zhuǎn)入擬南芥，兩種方法的平均轉(zhuǎn)化率分別為1.15%和0.48%。潮霉素抗性篩選，共獲得30株轉(zhuǎn)基因植株?；蚪MPCR以及RT-PCR檢測(cè)表明TuMV HC-Pro已整合到擬南芥基因組，并獲得表達(dá)。
　　以雪里蕻（Brassica juncea Coss. var. multiceps Tsen et Lee）子葉、帶柄子葉、子葉柄和下胚軸為外植體，在添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。結(jié)果表明：在4種外植體中,帶柄

6、子葉不定芽分化能力最強(qiáng)。子葉和帶柄子葉不定芽分化的最適培養(yǎng)基分別為MS+2 mg/L6-BA+0.4 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3和MS+2 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+5 mg/L AgNO3。帶柄子葉和子葉不定芽分化的最佳苗齡都為5 d。AgNO3能顯著地促進(jìn)帶柄子葉不定芽的分化，以5 mg/L的濃度為最佳。不同基因型對(duì)帶柄子葉不定芽分化影響不大，但對(duì)子葉影響較明顯。不定根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+0.2

7、 mg/L NAA。
　　用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，將反向重復(fù)TuMV HC-Pro基因轉(zhuǎn)化雪里蕻，初步構(gòu)建雪里蕻的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本論文研究了外植體類型、農(nóng)桿菌侵染濃度和時(shí)間，預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)和預(yù)篩選時(shí)間，以及篩選和抑菌抗生素的濃度等對(duì)雪里蕻轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：5 d苗齡的帶柄子葉，15 min農(nóng)桿菌侵染時(shí)間，OD600值0.6的侵染濃度，3 d的共培養(yǎng)和預(yù)篩選時(shí)間，15 mg/L Hyg篩選濃度，400 mg/L Car的抑菌濃