RPL9基因的原核表達(dá)和脂肪細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、近年來(lái)，有關(guān)豬脂肪沉積的研究備受關(guān)注，豬脂肪組織的形成從細(xì)胞生物學(xué)角度分析是脂肪細(xì)胞增殖、分化和凋亡共同作用的結(jié)果。因此，脂肪細(xì)胞分化的研究對(duì)豬的機(jī)體脂肪沉積具有重要的理論和實(shí)踐意義。借鑒實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在我國(guó)地方豬種太湖豬與國(guó)外瘦肉型豬種長(zhǎng)白豬脂肪組織的基因差異表達(dá)分析中，太湖豬核糖體蛋白 L9（RPL9）基因的表達(dá)量相比于長(zhǎng)白豬RPL9基因的表達(dá)量上調(diào)了16.1倍，這說(shuō)明RPL9基因可能對(duì)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控和脂肪酸代謝的平衡產(chǎn)生

2、影響,進(jìn)而影響脂肪沉積。因此,對(duì)RPL9進(jìn)行深入研究,探尋其與脂肪分化的關(guān)系，既為肉用家畜肉質(zhì)改良提供參考依據(jù)，又為進(jìn)一步研究豬 RPL9在動(dòng)物育種中的作用奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　（1）豬RPL9基因的克隆
　　參照 Genebank注冊(cè)的豬 RPL9基因序列（NM_001243481）設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用PCR技術(shù)，以豬肝臟組織cDNA為模板，擴(kuò)增579bp的豬RPL9基因全長(zhǎng)編碼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18

3、-T連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序，結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒豬Top10-pMD18-T-RPL9，該序列與NM_001243481登陸的序列同源性為100％。
　?。?）豬RPL9基因的原核表達(dá)以及純化
　　豬Top10-pMD18-T-RPL9經(jīng)雙酶切后與表達(dá)載體pET30a連接，隨后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，經(jīng)鑒定表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 BL21-pET30a-RPL9，隨后對(duì)重組質(zhì)粒BL21-pET30a-RPL9進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，

4、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子柱純化，初步獲得純化的目的蛋白。
　?。?）豬RPL9蛋白的生物信息學(xué)分析
　　利用生物信息學(xué)工具NCBI、ExPASy、SWISS-MODEL等對(duì)RPL9進(jìn)行理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、三級(jí)結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、進(jìn)化樹(shù)7個(gè)方面的分析，結(jié)果表明RPL9蛋白分子量為21863.4，等電點(diǎn)為9.96，為非跨膜親水性蛋白，成功預(yù)測(cè)其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)并繪制出其進(jìn)化樹(shù)。
　?。?）鼠RPL9基因的克隆
　　

5、參照Genebank注冊(cè)的鼠RPL9基因序列（NM_011292.2）設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用PCR技術(shù)，以鼠肝臟組織cDNA為模板，擴(kuò)增579bp的鼠RPL9基因全長(zhǎng)編碼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序，結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒鼠 Top10-pMD18-T-RPL9，該序列與NM_011292.2登陸的序列同源性為98.45％。
　?。?）鼠RPL9基因在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)
　　鼠Top10-pMD18-