轉(zhuǎn)TrxS基因啤酒大麥的分子檢測(cè)和表達(dá)分析.pdf

1、大麥?zhǔn)轻勗炱【频闹饕?。隨著我國(guó)啤酒產(chǎn)量的逐年增加，大麥?zhǔn)褂昧恳渤杀壤黾?。?002年起，我國(guó)成為世界啤酒第一生產(chǎn)大國(guó)，但國(guó)產(chǎn)啤酒大麥的生產(chǎn)和供應(yīng)相對(duì)滯后，主要原因之一在于國(guó)內(nèi)啤酒大麥在數(shù)量和質(zhì)量上都不能滿足啤酒工業(yè)的要求。目前我國(guó)啤酒大麥年需求量為300-350萬(wàn)噸，而國(guó)產(chǎn)啤酒大麥只有100多萬(wàn)噸，啤酒工業(yè)所需的啤酒大麥70％來(lái)自國(guó)外進(jìn)口，我國(guó)已成為世界上最大的啤酒大麥進(jìn)口國(guó)。啤酒大麥長(zhǎng)期依賴進(jìn)口，不僅影響啤酒企業(yè)健康的發(fā)展，而且

2、受制于人。因此，只有發(fā)展國(guó)內(nèi)啤酒大麥生產(chǎn)，啤酒工業(yè)的發(fā)展才能有可靠保證。 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行大麥品質(zhì)改良是大麥育種的一個(gè)新途徑。近年來(lái)，國(guó)外有關(guān)硫氧還蛋白h(Trxh)的研究，為應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行大麥品質(zhì)改良提供了可能。Trxh通過(guò)還原靶蛋白中的二硫鍵(S-S)，在許多反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，參與細(xì)胞的各種代謝活動(dòng)。研究表明，在種子發(fā)芽過(guò)程中，Trxh能促進(jìn)淀粉酶的活性提高，增加貯藏蛋白的水溶性，使種子中的貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易于水

3、解以促進(jìn)胚乳中的碳氮代謝。而啤酒大麥品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)如發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、麥芽浸出率、糖化力等，與大麥種子淀粉酶和蛋白酶活性關(guān)系密切。因此，Trxh活性的高低與啤酒大麥品質(zhì)之間有一定的相關(guān)關(guān)系。增加種子中Trxh的活性，有望改善大麥品質(zhì)。來(lái)源于藍(lán)色黑鴨草的TrxS基因，與硫氧還蛋白h基因有顯著的同源性，兩者的蛋白表達(dá)產(chǎn)物有相似的生物活性，具有硫氧還蛋白h的功能。將TrxS基因?qū)肫【拼篼溒贩N中，有望提高種子中的Trxh活性，為大麥品質(zhì)改良提供

4、新途徑。 本研究對(duì)獲得的轉(zhuǎn)TrxS基因啤酒大麥材料進(jìn)行了分子檢測(cè)、遺傳分析和大麥籽粒生理生化特性測(cè)定，從分子水平上驗(yàn)證了目的基因已整合在大麥基因組中，并能夠穩(wěn)定遺傳；目的基因在轉(zhuǎn)基因啤酒大麥中能夠正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并對(duì)目的基因的漂移和轉(zhuǎn)基因大麥的品質(zhì)性狀等進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下： 1.獲得轉(zhuǎn)TrxS基因啤酒大麥新品系 利用PCR、巢式PCR和PCR-Southern雜交等技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因啤酒大麥豫啤1號(hào)、晉引6號(hào)

5、和國(guó)外品種Harrington、Franklin后代植株進(jìn)行檢測(cè)，均檢測(cè)到陽(yáng)性植株。其中，豫啤1號(hào)、Franklin、Harrington的T1代PCR陽(yáng)性檢測(cè)率分別為50.6％、61.2％和67.3％；目的基因在不同材料中的遺傳行為不同，外源基因在Harrington、晉引6號(hào)中是以單拷貝的形式整合在大麥基因組上，并能夠穩(wěn)定地遺傳給后代；Franklin和豫啤1號(hào)部分株系符合3：1的比例，但在后代自交過(guò)程中，外源基因發(fā)生丟失。經(jīng)PCR

6、跟蹤檢測(cè)與分析，得到純合的轉(zhuǎn)基因大麥新品系，為進(jìn)一步進(jìn)行外源基因的表達(dá)與功能研究奠定了基礎(chǔ)。 2.初步明確了轉(zhuǎn)TrxS基因在啤酒大麥中的作用機(jī)理 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)表明目的基因?qū)氪篼満螅赗NA水平上能夠正常表達(dá)；對(duì)轉(zhuǎn)基因啤酒大麥籽粒中相關(guān)生理生化性狀研究分析結(jié)果表明：在種子發(fā)芽過(guò)程中轉(zhuǎn)基因大麥種子的Trxh活性顯著高于對(duì)照；種子發(fā)芽1-5d，轉(zhuǎn)基因種子α-淀粉酶的活性比對(duì)照分別增加了5.86％、75.24％、1

7、18.51％、71.02％和22.99％；β-淀粉酶活性比對(duì)照分別增加19.29％、14.68％、35.47％、23.62％和2.67％；轉(zhuǎn)基因大麥種子儲(chǔ)藏淀粉降解明顯加快，第二天和第三天轉(zhuǎn)基因種子的淀粉含量分別比第一天下降了3％和14％，而對(duì)照種子比第一天分別下降了1％和7.4％；轉(zhuǎn)基因種子的蛋白酶活性顯著高于對(duì)照，貯藏蛋白的降解速度加快；轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽勢(shì)明顯高于對(duì)照。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因通過(guò)提高水解酶的活性，加速種子貯藏物質(zhì)的分解，改善種子

8、的碳、氮代謝過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)，提高麥芽產(chǎn)量，為TrxS基因的利用提供了理論依據(jù)。 3.轉(zhuǎn)TrxS基因可以改善大麥麥芽品質(zhì) 經(jīng)品質(zhì)分析，轉(zhuǎn)基因大麥的糖化力、α-氨基氮和可溶性氮分別比對(duì)照提高了15％、11％和2.4％，麥汁過(guò)濾速率比對(duì)照提高了10.52％，說(shuō)明外源TrxS基因的導(dǎo)入，對(duì)大麥麥芽品質(zhì)有改進(jìn)作用。同時(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因小麥面粉的毒性分析，TrxS基因轉(zhuǎn)化后是無(wú)毒性的。 4.大麥優(yōu)異種質(zhì)的創(chuàng)育 通

9、過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將TrxS基因?qū)氲酱篼湻N質(zhì)資源中，獲得了含有TrxS的雜交后代，為大麥新品種選育提供了優(yōu)良親本。此外，轉(zhuǎn)TrxS基因可使大麥成熟提前2天，對(duì)大麥其它農(nóng)藝性狀無(wú)顯著影響；由于大麥特殊的開花習(xí)性，TrxS基因在較小的范圍內(nèi)有漂移，并與風(fēng)向有一定的關(guān)系。 綜上所述，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因啤酒大麥的分子檢測(cè)和遺傳分析，獲得了轉(zhuǎn)基因大麥新品系，同時(shí)證明了目的基因在轉(zhuǎn)基因大麥中能夠正常表達(dá)，并且改善了種子的碳氮代謝，有利于改