家蠶β-呋喃果糖苷酶的定點(diǎn)突變與功能性活性位點(diǎn)研究.pdf

1、桑葉的乳汁中含有高濃度的糖類似生物堿，如：D-AB1、脫氧野尻霉素（DNJ）、1,4-二脫氧-1,4-亞氨基-D-核糖醇等，對α-葡萄糖苷酶（EC.3.2.1.20）具有抑制作用，但不能抑制β-呋喃果糖苷酶（β-FFase，EC.3.2.1.26）的活性。DNJ對蓖麻蠶、甘藍(lán)夜蛾等非食桑昆蟲幼蟲具有明顯的毒性，阻礙幼蟲的生長。家蠶（Bombyx mori）是以桑葉為唯一營養(yǎng)來源的昆蟲，DNJ等生物堿對家蠶并沒有表現(xiàn)出毒性作用，說明家蠶具

2、有抵抗桑葉生物堿防御系統(tǒng)的能力。繼家蠶β-FFase基因（BmSuc1）被克隆鑒定之后，來自鱗翅目、鞘翅目等多種昆蟲的β-FFase基因先后被發(fā)現(xiàn)。然而，BmSUC1作為蔗糖水解酶，其在家蠶避免生物堿毒害作用的分子調(diào)控機(jī)制中的功能還不明確；關(guān)于昆蟲β-FFase的酶活中心、關(guān)鍵酶活性位點(diǎn)及底物結(jié)合位點(diǎn)尚缺乏調(diào)查和了解。
　　β-FFase屬于糖苷水解酶GH32家族。為了調(diào)查家蠶β-FFase的活性位點(diǎn)及其活性特征，本研究通過 Bm

3、SUC1與其他物種β-FFase同源序列的比對，發(fā)現(xiàn)GH32家族酶中與酶活相關(guān)的三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸（WMNDPNG，RDP， EC）在BmSUC1中同樣是保守的。利用重疊延伸PCR的方法將Asp63、Asp181、Glu234分別定點(diǎn)突變成 Ala，構(gòu)建基于三個(gè)突變（D63A、D181A、E234A）的pFastBac Dual重組表達(dá)載體。利用大腸桿菌-桿狀病毒（Bac-to-Bac）表達(dá)系統(tǒng)在家蠶卵巢細(xì)胞（BmN）中進(jìn)行體外

4、重組蛋白的表達(dá)、純化和活性測定。最后采用蒸發(fā)光檢測器-HPLC法對活性顯著增加的D181A突變型的酶活特性進(jìn)行定性和定量鑒定。本研究得到以下主要結(jié)果：
　　1）分別收集真核表達(dá)體系的各組分，即細(xì)胞外（培養(yǎng)液）、細(xì)胞內(nèi)上清和細(xì)胞內(nèi)沉淀），進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果顯示重組蛋白主要存在于細(xì)胞培養(yǎng)液中，分子量約56KDa，與理論預(yù)測值基本一致。
　　2）通過大量表達(dá)并經(jīng)Ni-NTA親和色譜層析柱分離純

5、化重組蛋白和Western blot分析，獲得了純度較高的的野生型BmSUC1和三個(gè)突變型重組蛋白。
　　3）以蔗糖為底物進(jìn)行酶活反應(yīng)，利用DNS法檢測酶的活性。結(jié)果表明，野生型BmSUC1的最適pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為30℃，而D63A和E234A突變在pH5～9、反應(yīng)溫度15～60℃范圍內(nèi)均表現(xiàn)出幾乎沒有活性，說明該兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)是BmSUC1的關(guān)鍵性活性位點(diǎn)。有趣的是，D181A的活性顯著高于野生型BmSUC1，其最適反

6、應(yīng)溫度也為30℃，而最適pH為6.0。
　　4）酶的活性動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明D181A突變型對蔗糖和棉籽糖的底物親和性都高于野生型BmSUC1。HPLC分析發(fā)現(xiàn)BmSUC1和D181A催化的酶促反應(yīng)產(chǎn)物的中均含有果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖和6-蔗果三糖，表明 D181A和 BmSUC1一樣，不僅具有蔗糖水解酶的活性，同時(shí)表現(xiàn)出果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，與GH32家族的酶活特性一致，并且D181A的水解酶活性和果糖基轉(zhuǎn)移酶活性都顯著高

7、于野生型BmSUC1。
　　總之，本研究通過定點(diǎn)突變的方法對 BmSUC1的預(yù)測活性位點(diǎn)進(jìn)行功能性探究，發(fā)現(xiàn)D63A、D181A和E234A突變對酶的活性均產(chǎn)生了明顯影響。細(xì)菌、真菌及植物β-FFase的晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明，D63起親核攻擊作用，E234則作為酸堿催化位點(diǎn)起到質(zhì)子傳遞作用，對于 BmSUC1來說，該兩個(gè)位點(diǎn)可能具有同樣重要的功能。一般認(rèn)為D181位點(diǎn)對底物的過渡態(tài)起到穩(wěn)定作用，至于D181A突變導(dǎo)致BmSUC1活