CDK2AP1,SMARCE1及PGCs在雞胚性腺發(fā)育中的作用研究.pdf

1、雞胚性腺是重要的動物器官發(fā)生研究模型，雞的性別決定基因還沒有確定，性腺分化相關基因的研究還不深入，高效利用雞胚性腺模型及建立實用的性反轉技術需要加強對性腺分化相關基因的研究。白消安處理雞胚是獲得嵌合體雞受體雞胚的有效方法，然而不同劑量白消安對雞胚成活率的影響及對原始生殖細胞的敲除效率還有待深入研究。本研究圍繞性腺發(fā)育相關基因的表達和白消安處理雞胚的工作，引入并優(yōu)化整體原位雜交技術，利用整體原位雜交并結合半定量反轉錄聚合酶鏈式反應和免疫組

2、化技術檢測雞胚性腺分化相關基因Cdk2ap1在組織水平的時空表達；合成雞胚性腺分化相關基因Smarcel的RNA探針，比較超表達后該基因的表達變化及睪丸和卵巢組織形態(tài)的變化；研究白消安對雞在胚胎期成活率、原始生殖細胞數目及對睪丸和卵巢組織形態(tài)的影響。具體研究內容及結論如下：
　　 在雞胚研究中引入整體原位雜交技術，研究雞Cdk2ap1基因的表達，先設計Cdk2ap1引物并通過半定量反轉錄聚合酶鏈式反應擴增Cdk2ap1基因片段，

3、構建Cdk2ap1/pGEM-T重組質粒。以構建的重組質粒為模板，使用Sp6和T7 RNA聚合酶合成地高辛標記的正、反義RNA探針，通過控制蛋白酶K消化的濃度、探針雜交的濃度，以及雜交后的洗滌溫度，得到了低本底、著色清晰的雜交結果，在本實驗室建立了雞胚整體原位雜交方法。為探討Cdk2ap1基因在雞胚胎發(fā)育過程中的表達，借助建立的胚胎整體原位雜交技術研究了Cdk2ap1在4.0 d雌雄雞胚中的表達。結果表明Cdk2ap1基因在4.0 d兩

4、性胚胎的腦間質、菱腦、聽囊、脊神經管、前肢等部位均有表達，且在雄性雞胚中的表達量高于雌性。在雄性雞胚的生殖脊、后肢部位中該基因有表達但在雌性胚胎對應部位卻基本沒有表達。利用半定量反轉錄聚合酶鏈式反應、整體原位雜交和免疫組織化學染色法研究6.5-10.5 d雞胚性腺中Cdk2ap1的表達，結果發(fā)現該基因隨著胚胎的發(fā)育表達下調，在雌性性腺中的表達高于雄性性腺中的表達。鑒于該基因在雌雄雞胚中的差異表達，推測Cdk2ap1基因在雞胚性腺發(fā)育及性

5、別分化過程中起一定調節(jié)作用。
　　 為了研究Smarcel在鳥類性別決定和分化中的潛在作用，用RCASBP.B逆轉錄病毒載體超表達處理雞胚，整體原位雜交和免疫組化研究表明該基因在感染雞胚中上調表達。利用HE染色觀察12.5 d雌雄性腺組織形態(tài)，結果表明重組逆轉錄病毒感染的雞胚卵巢皮質比對照組厚、雞胚睪丸中的曲細精管索和間質細胞數多于對照組。鑒于該基因對睪丸和卵巢組織形態(tài)的增生作用，推測SMARCE1能同時促進雌雄性腺的發(fā)育。

6、r>　　 使用不同劑量白消安(0μg，120μg，240μg，360μg and480μ9)處理雞胚后，統(tǒng)計不同日齡雞胚的成活率，并利用免疫組織化學染色檢測雞胚原始生殖細胞表面抗原SSEA-1的表達，統(tǒng)計分析雞胚性腺中原始生殖細胞數目的變化。采用HE染色觀察白消安處理雞胚后8.5 d、11.5 d和14.5 d睪丸和卵巢的組織形態(tài)變化。結果表明低劑量(<120μg)的白消安處理對雞胚成活率沒有明顯影響(P>0.05)，而中劑量(240

7、μg and360μg)的白消安處理顯著降低雞胚成活率(P<0.05)，高劑量(480μg)的白消安處理進一步降低雞胚的成活率(P<0.05)。睪丸和卵巢對白消安處理的反應不同，在睪丸中存在原始生殖細胞數目的自調節(jié)，而卵巢中的原始生殖細胞對白消安幾乎沒有反應。低劑量白消安對雞胚性腺組織形態(tài)沒有影響，睪丸曲細精管索數目沒有變化，卵巢皮質厚度正常，髓質內細胞排列和細胞數目正常。隨著白消安劑量的增加，雞胚性腺形態(tài)開始發(fā)生異常。高劑量白消安處理