穩(wěn)定高效表達(dá)豬CD163的MARC-145細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，該病以妊娠母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀為主要特征，并且能破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感

2、染或繼發(fā)感染，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失?，F(xiàn)階段使用疫苗免疫仍是防治PRRS流行的主要手段。
　　病毒的體外分離和鑒定是研究和防治PRRS的基礎(chǔ)和前提，而PRRSV表現(xiàn)出相當(dāng)嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，在體外培養(yǎng)時僅能感染豬肺泡巨噬細(xì)胞、豬脾巨噬細(xì)胞和源于MA-104的幾個亞細(xì)胞系(MARC-145、CL2621、HS.2H)。由于最容易感染PRRSV的巨噬細(xì)胞難于獲得且只能原代培養(yǎng)，操作成本高昂，而且目前常用的MARC-145細(xì)

3、胞雖然可以增殖PRRSV，但是存在著PRRSV增殖速度慢、滴度低的局限性，因此建立一種能夠快速、高效地增殖PRRSV的細(xì)胞系成為當(dāng)務(wù)之急。
　　PRRS侵染宿主細(xì)胞的第一步是與細(xì)胞上的受體結(jié)合，研究表明CD163作為PRRSV的受體介導(dǎo)病毒的脫衣殼和病毒核酸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的釋放，與PRRSV的感染密切相關(guān)，并且Patton等人的研究結(jié)果表明PRRSV的感染能力與CD163受體的表達(dá)水平具有直接的相關(guān)性。因此，本研究旨在構(gòu)建一株能夠穩(wěn)定

4、、高效表達(dá)CD163的MARC-145細(xì)胞系，從而能夠高效、快速地增殖PRRSV，為PRRSV的相關(guān)研究和疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究根據(jù)GenBank中收錄的相關(guān)序列設(shè)計引物從PAM（豬肺泡巨噬細(xì)胞）中擴增pCD163基因，將其插入真核表達(dá)載體pCI-neo構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-pCD163，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，通過G418篩選、單克隆化并擴大培養(yǎng)篩選獲得表達(dá)豬CD163的MARC-145細(xì)胞系，命名為pC

5、D163-MARC。間接免疫熒光(IFA)結(jié)果顯示，構(gòu)建的pCD163-MARC細(xì)胞系中熒光強度明顯高于普通MARC-145細(xì)胞;Western blot結(jié)果顯示pCD163-MARC細(xì)胞系中pCD163蛋白表達(dá)量約為對照MARC-145細(xì)胞中pCD163蛋白表達(dá)量的8.7倍。且該細(xì)胞系可穩(wěn)定傳至20代，各代次之間pCD163蛋白表達(dá)量無明顯差異。將pCD163-MARC細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞同時感染1MOI的PRRSV經(jīng)典株SD-

6、1株和高致病性毒株SD-JN株，測定pCD163-MARC和MARC-145細(xì)胞增殖PRRSV的生長曲線實驗表明pCD163-MARC細(xì)胞增殖兩株病毒的滴度有了明顯提高。RT-PCR實驗亦表明pCD163-MARC細(xì)胞增殖的PRRSV的RNA量明顯高于MARC-145細(xì)胞。
　　在該細(xì)胞系的應(yīng)用方面，我們將本實驗室2012.06-2014.06期間RT-PCR檢測陽性的PRRSV病料樣品120份同時接種pCD163-MARC細(xì)胞與

7、MARC-145細(xì)胞，盲傳5代后兩者對PRRSV的分離率分別為100％和80％，pCD163-MARC細(xì)胞顯然具有更高的PRRSV分離率，更適合于臨床PRRSV的分離培養(yǎng)。我們將pCD163-MARC細(xì)胞與MARC-145細(xì)胞擴大至轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，同時感染1MOI的廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司生產(chǎn)的PRRS疫苗JXA1-R株，96 h收毒，結(jié)果顯示病毒在pCD163-MARC細(xì)胞上的滴度為1×108.5TCID50/mL，在MARC-14