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文檔簡介
1、顆粒細胞是卵巢中十分重要的體細胞,其在發(fā)育的不同階段合成和分泌激素以及多種生長因子,并通過自分泌或旁分泌途徑發(fā)揮作用。顆粒細胞對卵母細胞成熟、卵泡發(fā)育有至關重要的作用。顆粒細胞的凋亡是導致卵泡閉鎖的很重要的原因。如果一個發(fā)育卵泡中10%以上的顆粒細胞發(fā)生凋亡,則表明該卵泡已經或正在閉鎖。曲古抑菌素A是一種重要的組蛋白去乙?;敢种苿?近年來研究發(fā)現(xiàn),其對多種腫瘤細胞具有抑制作用,作用機理包括誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期和促進細胞分化等
2、。組蛋白去乙?;敢种苿┳鳛橐环N非常有前景的抗腫瘤藥物,其對機體正常細胞的作用尚待研究。因此,本試驗以TSA為代表藥物,研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑對豬卵巢顆粒細胞的作用,并就其機理作初步探討,以為臨床用藥提供一定的參考。具體研究內容如下。
采用MTT法測定組蛋白去乙?;敢种苿㏕SA對豬卵巢顆粒細胞活性的影響。結果顯示:TSA在低濃度時(10ng/mL以下)對豬卵巢顆粒細胞的生長沒有影響,但隨著藥物濃度的增加,豬卵巢顆粒細
3、胞的生長受到抑制(P<0.05),且這種抑制作用具有劑量依賴性。在10ng/mL和200ng/mL,時,隨著處理時間的延長,在48h時略有升高,而在72h時又降低,但各時間點測定的OD550值差異不顯著(P>0.05),表明TSA對豬卵巢顆粒細胞生長抑制不具有時間依賴性。
利用間接免疫熒光研究組蛋白去乙?;敢种苿㏕SA對正常豬卵巢顆粒細胞乙酰化水平的影響,并利用熒光定量PCR技術從分子水平對機制做進一步研究。間接免疫熒光
4、結果顯示,200 ng/mL TSA處理的顆粒細胞與對照組比較組蛋白H3乙?;阶兓@著,而在低濃度下(10 ng/mL)變化不顯著。熒光定量PCR結果顯示,200ng/mLTSA處理24h,Hadc-1、Hadc-3和p300 mRNA表達與空白對照組比較差異顯著(P<0.05),在低濃度(10 ng/mL)時,差異不顯著(P>0.05)。表明TSA在較高濃度下影響正常顆粒細胞的乙?;?而在低濃度下對顆粒細胞乙酰化水平不產生影響
5、。
采用流式細胞儀檢測不同濃度曲古抑菌素A(TSA)作用于顆粒細胞24h后,顆粒細胞凋亡率的變化,以確定凋亡是否為TSA作用后顆粒細胞生長抑制的機制。結果顯示:200ng/m TSA處理組的細胞凋亡率為13.7%,高于空白對照組9.1%,差異顯著(P<0.05);10ng/mL處理組與空白對照相比,凋亡率無明顯差異(P>0.05),表明高濃度TSA促進顆粒細胞活性凋亡,細胞凋亡是顆粒細胞活性的影響方式之一。
6、采用流式細胞儀檢測不同濃度曲古抑菌素A(TSA)作用于顆粒細胞24h后,顆粒細胞周期的變化情況,并利用熒光定量RT-PCR技術從分子水平對細胞周期相關基因進行研究。流式細胞術結果顯示:與空白對照組相比,200 ng/mL TSA處理24 h后,G0/G1期細胞百分比有明顯的上升(P<0.05),S期細胞百分比顯著降低(P<0.05),G2/M期細胞百分比差異不顯著。而低濃度(10 ng/mL)處理各期細胞百分比無明顯變化。同樣,熒光定量
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