FLP-frt位點特異性重組系統(tǒng)在玉米中的應用及轉TsVP抗旱玉米的獲得.pdf

1、干旱和鹽漬已經(jīng)成為限制世界農(nóng)作物增產(chǎn)的主要原因。隨著人口增長和對生物質能源的迫切需求，增加作物產(chǎn)量已成為當務之急，利用生物技術培育耐鹽抗旱作物品種具有重要的戰(zhàn)略意義。玉米(Zea mays L.)是世界上重要的糧食、飼料兼能源作物，也是重要的工業(yè)原料。玉米需水較多、對干旱比較敏感，耐鹽性差，低度鹽堿可使其產(chǎn)量大幅度減少。采用傳統(tǒng)的育種方法因缺乏種質資源等因素很難獲得玉米耐鹽抗旱新品種，基因工程的發(fā)展加快了玉米育種工作前進的步伐，為培育玉

2、米耐鹽、抗旱新品種開辟了新途徑。目前，玉米耐鹽、抗旱基因工程研究尚處在初級階段，受到國內(nèi)外玉米育種工作者的關注。 隨著轉基因作物播種面積的快速增長，用以篩選轉基因植物的選擇標記基因(如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因等)的使用引發(fā)了人們對轉基因植物安全性的隱憂，影響了消費者對轉基因產(chǎn)品的接受程度，也不利于對同一個品種進行多次轉基因操作。因此，培育無選擇標記基因或具有安全選擇標記基因的轉基因作物倍受重視。來自于啤酒酵母2μm質粒的F

3、LP/frt位點特異性重組系統(tǒng)中重組酶FLP可催化位于同一分子上兩個同向frt位點間DNA片段的切除，利用該系統(tǒng)可實現(xiàn)植物轉基因細胞篩選完成后選擇標記基因的刪除。 基于對上述問題的考慮，本研究開展了采用FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)刪除轉基因玉米中選擇標記基因的工作，對其刪除效率進行了分析，并對提高刪除效率的策略進行了探討。本工作不僅培育出了耐鹽抗旱的無選擇標記的轉基因優(yōu)良玉米新材料，而且為批量獲得無選擇標記基因的轉基因玉米提

4、供了成套技術。 主要結果和結論如下： 適合于單子葉植物的FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)的構建和應用本工作通過多輪DNA重組實驗構建出適合單子葉轉基因植物去除選擇標記基因的定點重組系統(tǒng)，包括適合于單子葉植物的FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)和熱誘導型FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)。本工作中，為了提高在轉基因植物中的重組效率，在FLP重組酶基因編碼區(qū)起始密碼子ATG前添加了植物最適翻譯修飾序列AACA；在含有frt位點的

5、植物表達載體中位于選擇標記基因als兩側的frt位點，一個是全長序列，另一個為僅包含核心重組序列的截短的frt位點(frtm)。在構建適合于單子葉植物的FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)時，分別以水稻Actinl啟動子啟動AtNHX1基因、以玉米泛素ubiquintin基因啟動子Ubi啟動TsVP和FLP基因的轉錄，以期轉基因能在玉米中高效表達。為了提高選擇標記基因的刪除效率，使FLP重組酶能夠在玉米植株中于特定時期發(fā)揮作用，減少重組酶的

6、過量及長期表達對植株的傷害，我們又構建了熱誘導型FLE/frt位點特異性重組系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，F(xiàn)LP重組酶基因由熱誘導啟動子hsp啟動，使其在熱激條件下能夠特異表達。利用農(nóng)桿菌介導法獲得了分別轉FLP重組酶基因、AtNHX1及als基因、TsVP及als基因的轉基因植株，通過連續(xù)自交得到了穩(wěn)定的轉基因純合系。利用這些轉基因純合系進行選擇標記基因刪除實驗。在有性雜交去除選擇標記基因途徑中，檢測到選擇標記基因的刪除頻率為40.35％，其中以

7、攜帶FLP重組酶基因的植株為母本進行有性雜交得到的F1植株中選擇標記被刪除的頻率略高于以其作為父本的，而且als基因被刪除的結果可以穩(wěn)定遺傳到后代。對F1植株中FLP重組酶的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，當F1植株與帶有frt位點的轉基因植株雜交后，子代植株中的重組酶基因FLP仍然可以發(fā)揮功能，作用于frt位點介導重組事件的發(fā)生。當細胞內(nèi)導入兩對frt位點及選擇標記基因時，只在20％左右的植株中檢測到選擇標記基因被完全刪除，即選擇標記基因被完全刪除的

8、頻率大幅度降低。 分別以轉AtNHX1及als基因的植株和轉hap啟動的FLP重組酶基因的植株為父、母本進行有性雜交，然后通過原位果穗熱激和未成熟胚離體培養(yǎng)熱激兩種方式誘發(fā)選擇標記基因的刪除并進行刪除頻率的比較。前一方式是在授粉后不同時間進行熱激處理，以授粉后24h在42℃下熱激1h時誘發(fā)的刪除頻率最高，去除選擇標記基因的種子達60.36％。后一方式是將未成熟胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后在不同時間進行熱激處理，以離體培養(yǎng)24h

9、時熱激(42℃)1h的去選擇標記基因的頻率最高，達到50％。 同已報道工作相比較，本工作為提高單子葉轉基因植物生物安全性提供了有競爭力的技術體系。 去除選擇標記基因的轉AtNHX1基因玉米的耐鹽性分析擬南芥液泡膜Na+/H+反向轉運蛋白(AtNHX1)在擬南芥耐鹽中起有重要作用。本工作將AtNHX1基因導入到玉米植株中，以FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)去除選擇標記基因als，得到了耐鹽性明顯提高而無選擇標記基因的轉基因

10、玉米。Southern雜交表明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中并在后代穩(wěn)定遺傳。RT-PCR結果表明外源基因在玉米中能夠穩(wěn)定表達。轉AtNHX1基因玉米，無論是在鹽脅迫處理前還是在鹽脅迫處理過程中，轉基因植株均具有比未轉基因對照植株顯著提高的液泡膜Na+/H+交換活性，而且在鹽處理過程中轉基因植株有更高的Na+吸收速率，這說明AtNHX1基因的表達促進了轉基因植株中Na+向液泡中的區(qū)隔化分布，從而避免了細胞質中過量Na+對細胞的傷害。在脅

11、迫處理中轉基因植株的Na+含量要高于未轉基因對照植株的，差異達到顯著或極顯著程度。與此同時，與未轉基因對照相比，轉AtNHX1基因植株的葉片和根中積累了更多的Cl-和K+。這樣，轉基因植株通過無機離子的大量積累維持較低的細胞溶質勢，在鹽脅迫下能夠較好的保持水分和維持細胞膨壓，免受或減輕了鹽脅迫造成的傷害。在鹽脅迫處理下轉基因株系與未轉基因株系相比具有了更高的種子萌發(fā)率和更多的生物量，轉基因植株具備了較好的耐鹽性。本工作為我國玉米育種創(chuàng)造

12、出了優(yōu)異的新材料。 轉TsVP基因玉米株系的抗旱性分析本工作通過農(nóng)桿菌介導法將來自鹽芥的編碼H+-PPase的基因TsVP導入玉米骨干自交系魯原92和掖478中，獲得了轉基因植株。分子鑒定表明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，且其表達強度在不同株系中有差異。通過對轉基因植株后代苗期和開花期的抗旱性分析，肯定了轉基因玉米的抗旱性有了明顯的提高。 在干旱脅迫條件下，轉基因TsVP的表達促進了轉基因玉米根系的生長，顯著增加了轉基

13、因植株的生物量和根冠比。如轉基因株系L1在干旱脅迫處理后，其地上部分和地下部分及其根冠比分別比經(jīng)歷同樣處理的未轉基因對照株系高31.6％、76.4％和36.4％。發(fā)達的根系有利于植物對水分的吸收，尤其是在土壤含水量較低的情況下。較發(fā)達的根系可能是轉基因植株抗旱性提高的形態(tài)學基礎。苗期抗?jié)B透脅迫檢測結果表明，轉TsVP基因玉米植株的抗?jié)B透脅迫能力與其H+-PPase酶活性呈正相關。脅迫條件下，轉基因株系具有較高的種子萌發(fā)率，葉片能夠保持相

14、對較高的水分含量，細胞膜損傷和膜脂過氧化程度較輕，細胞中積累了更多的可溶性糖和脯氨酸，維持了較低的溶質勢。即TsVP基因的轉入使得轉基因玉米苗期的抗?jié)B透脅迫能力得到明顯的提高，其可能的原因是：1、植株有較發(fā)達的根系，有利于干旱條件下的水分吸收；2、干旱脅迫下轉基因植株通過積累大量的有機溶質，維持了較低的溶質勢，有利于細胞保持水分，免受干旱脅迫的傷害。玉米生殖生長期的抗旱性對于產(chǎn)量是至關重要的。對10葉期的大田玉米進行了為期6周的干旱脅迫

15、處理，在脅迫處理的0、1、5、10和14天時取材測定細胞膜離子滲漏率和丙二醛含量、葉片相對含水量及可溶性總糖、脯氨酸含量等。結果與苗期進行的滲透脅迫實驗結果相符合，即在脅迫處理過程中轉基因植株細胞內(nèi)合成了更多的可溶性物質，使葉片保持較高的相對含水量，降低了細胞膜損傷程度。同時，轉基因植株的雌雄穗開花間隔天數(shù)ASI(anthesis-silking interval)少于未轉基因對照植株的，差異顯著。經(jīng)歷干旱處理后，轉基因株系的穗重和粒重

16、明顯高于對照株系的，差異達到顯著或極顯著程度。其中株系L1和L4的千粒重分別比對照株系多27.6％和23.0％；Y1和Y4的則分別比對照株系多15.4％和19.0％。這些結果表明，TsVP基因的轉入可明顯提高玉米植株生殖生長期的抗旱能力。 本工作首次將來自鹽芥的編碼H+-PPase的TsVP基因轉入玉米，通過轉基因植株后代的抗旱性分析肯定了H+-PPase在玉米抗旱機制中有重要作用，并且獲得了干旱脅迫后產(chǎn)量明顯高于未轉基因對照植