家蠶細(xì)小病毒樣病毒(中國株)主要基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)及定位.pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒(Bombyx mori parvo-likevirus,BmPLV)是一種二分病毒。該病毒在家蠶中腸柱狀細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和包裝,感染的細(xì)胞核呈現(xiàn)過分膨脹、細(xì)胞核孚爾根濃染等細(xì)胞病理學(xué)特征。病毒粒子直徑20～24nm,無囊膜呈球型,衣殼呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。其基因組為單鏈線性雙分子DNA(VDI、VD2),大小分別是6.6kb、6.1kb,分別獨(dú)立包裝在各自的衣殼中。該病毒基因組編碼四個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3和

2、pol(DNApolymerase),一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白VP和一個(gè)次要結(jié)構(gòu)蛋白P133。VD1、VD2末端具有的反向重復(fù)序列可形成與BmPLV復(fù)制有關(guān)的“鍋柄形”結(jié)構(gòu)以及含自身編碼DNA聚合酶序列,推測該病毒基因組的復(fù)制方式與腺病毒相類似,以末端結(jié)合蛋白為起始復(fù)合物開始復(fù)制的。家蠶細(xì)小病毒樣病毒粒子的特征研究仍然停留在比較原始的狀態(tài),缺乏更精細(xì)的外觀研究。所以本實(shí)驗(yàn)從病毒的結(jié)構(gòu)特征著手進(jìn)行相關(guān)的研究,進(jìn)而對病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白組分及衣殼蛋白排

3、布情況作了解析及推測。此外,由于DNA聚合酶是病毒基因組復(fù)制表達(dá)所必須的早期蛋白而VP蛋白在病毒粒子衣殼裝配中所必須的且是衣殼主要組成部分,所以通過對DNA聚合酶和VP蛋白研究可以說明病毒粒子在家蠶中腸增殖過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)及定位情況。
　　 1、病毒粒子的電鏡觀察
　　 將感病家蠶蠶糞進(jìn)行勻漿、粗濾、硫酸銨沉淀等粗提,以便去除病毒液中的色素、脂質(zhì)和雜蛋白等雜質(zhì)。再經(jīng)蔗糖和氯化銫兩步密度梯度離心等精提,獲取高純度病毒粒子。

4、經(jīng)透析后的病毒粒子進(jìn)行2%磷鎢酸負(fù)染后,用透射電鏡進(jìn)行觀察。在電鏡下放大400,000倍可觀察到病毒粒子呈現(xiàn)均一的球形結(jié)構(gòu),直徑約為22nm,表面有許多小子粒凸起。其外觀結(jié)構(gòu)跟犬細(xì)小病毒相類似,在表面有囊突結(jié)構(gòu),凹凸花紋也與犬細(xì)小病毒粒子的相似,它的表面最突出的特點(diǎn)是按五重軸方向觀看有凸起感,在定點(diǎn)處有尖刺狀結(jié)構(gòu),據(jù)此推測衣殼蛋白可能是5-3-2對稱的,按T=1的對稱二十面體結(jié)構(gòu)排列。提純的病毒粒子在氯化銫高鹽低溫環(huán)境放置30天后的病毒

5、也均勻排布,但是結(jié)構(gòu)不夠完整,出現(xiàn)空殼結(jié)構(gòu)或者部分片狀結(jié)構(gòu)。
　　 2、結(jié)構(gòu)蛋白組分
　　 利用SDS-PAGE電泳分離技術(shù)對提純的病毒粒子進(jìn)行蛋白組分分析,比較病毒結(jié)構(gòu)蛋白的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,冷凍處理病毒粒子蛋白分析有2蛋白條帶,大小分別是55kDa、53kDa;而經(jīng)過高鹽處理的病毒粒子蛋白分析卻有4個(gè)條帶,大小為55kDa、53kDa、29kDa、26kDa。高鹽降解處理的病毒粒子蛋白組分要比冷凍儲(chǔ)存的病毒粒子結(jié)構(gòu)

6、蛋白組分多,29kDa、26kDa條帶在完整病毒液中均未檢測到。對高鹽降解的蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果顯示是病毒結(jié)構(gòu)蛋白。未檢測到的蛋白的現(xiàn)象與犬細(xì)小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白消失現(xiàn)象有極大淵源。
　　 3、vp和pol在家蠶中腸增殖過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)及定位
　　 本實(shí)驗(yàn)主要采用組織冷凍切片和免疫熒光反應(yīng)技術(shù),檢測該病毒進(jìn)入中腸后主要基因表達(dá)動(dòng)態(tài)。首先,選擇對病毒敏感品種華八三五和具有抗性的秋豐。桑葉飼養(yǎng)幼蟲至四齡,在四齡起蠶12h進(jìn)

7、行涂葉添毒,分別在0h-144h十個(gè)時(shí)間點(diǎn)剖取中腸組織。其次,家蠶中腸經(jīng)多聚甲醛固定后在20%蔗糖中保存。去處理過的中腸組織用OCT冷凍包埋并進(jìn)行切片。最后,用VP、pol抗體和綠色熒光二抗FITC顯色,同時(shí)用藍(lán)色熒光DAPI作為核定位參考內(nèi)參,用熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。結(jié)果顯示:
　　 1)、pol基因表達(dá)動(dòng)態(tài)及定位:華八三五添毒36h,中腸柱狀細(xì)胞中可觀察到綠色熒光信號,熒光信號都集中在核的位置處,而秋豐未檢測