家蠶細(xì)小病毒樣病毒VD1-ORF4主要結(jié)構(gòu)域的研究.pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒(Bombyx mori parvo-like virus,BmPLV)是動(dòng)物病毒中的首例二分DNA病毒,能夠使家蠶罹患嚴(yán)重的濃核癥。該病毒粒子直徑為22～24nm,無(wú)囊膜包裹,呈球型。其特點(diǎn)是基因組為單鏈線性、雙分子DNA(VD1、VD2),且兩條單鏈分別獨(dú)立包裝在不同的衣殼中,DNA末端的反向重復(fù)序列中無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。它的另一顯著特征是基因組的VD1-ORF4編碼DNA聚合酶,命名為pol基因。這些特征預(yù)示該病毒的復(fù)制

2、機(jī)制完全不同于細(xì)小病毒。開啟VD1-ORF4功能特性研究,是探索該病毒復(fù)制機(jī)制的關(guān)鍵。
　　 VD1-ORF4含有3318個(gè)堿基,編碼分子量為128KDa,1105個(gè)氨基酸的多肽,命名為P128。該蛋白的N端(1～326位氨基酸)功能未知,C端包含DNA聚合酶B家族2特征氨基酸序列,該家族是以蛋白為引發(fā)的DNA聚合酶。Pol基因中327～612位的氨基酸含有在原核和真核生物DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性結(jié)構(gòu)域的保守基序Exo

3、Ⅰ(DxE)、ExoⅡ(Nx3F/YD)和ExoⅢ(Yx3D);699～1002位的氨基酸含有DNA聚合酶聚合結(jié)構(gòu)域的保守基序:Dx2SLYP(Ⅰ)、Kx3NSxYG(Ⅱ)、Tx2G/AR(Ⅲ)、YxDTDS(Ⅳ)和KxY(Ⅴ)。
　　 本論文主要對(duì)家蠶細(xì)小病毒樣病毒VD1-ORF4基因主要結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了以下三個(gè)部分的研究:(1)克隆和表達(dá)VD1-ORF4的N端326個(gè)氨基酸的多肽,并制備多克隆抗體,以該抗體檢測(cè)病毒粒子中的蛋白;

4、(2)克隆和表達(dá)VD1-ORF4的polmotif,并制備多克隆抗體,以該抗體檢測(cè)分析在感病的宿主體內(nèi)P128蛋白的表達(dá)時(shí)相;(3)在桿狀病毒Multibac系統(tǒng)表達(dá)P128蛋白,以期提高其表達(dá)量,獲得具有生物活性的蛋白。
　　 1、ORF4的N端和ORF4聚合結(jié)構(gòu)域的克隆及原核表達(dá)
　　 以pET-30a(+)作為原核表達(dá)載體,用IPTG誘導(dǎo),在E.coliBL21中進(jìn)行病毒基因VD1-ORF4N端(ORF4-N)和聚

5、合結(jié)構(gòu)域(POL)的原核表達(dá)。表達(dá)的ORF4-N蛋白和POL蛋白的大小與預(yù)測(cè)的相一致。利用His抗體對(duì)原核表達(dá)融合蛋白進(jìn)行westernblot分析,結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白為與His融合的目的蛋白。
　　 2、ORF4的N端和ORF4聚合結(jié)構(gòu)域抗體的制備
　　 利用Ni-NTA柱純化重組蛋白His-ORF4-N和His-POL,將純化到的重組蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔,制備抗血清anti-ORF4-N和anti-POL。用

6、ELISA技術(shù)檢測(cè)抗體的效價(jià)為1:6500,高于1:2000,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)ProteinA親和凝膠柱獲得純化的抗血清。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示只有抗體的重輕兩條鏈,純化效果良好。
　　 3、DNA聚合酶表達(dá)時(shí)相分析
　　 對(duì)5齡家蠶經(jīng)口添食病毒(BmPLV),在添食病毒后的不同時(shí)間點(diǎn)取家蠶的中腸。樣品經(jīng)組織裂解液處理后,以anti-POL為一抗,以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗,經(jīng)westernbl

7、ot檢測(cè)P128在家蠶中腸的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在添食病毒后的家蠶中腸組織中,DNA聚合酶蛋白的表達(dá)動(dòng)態(tài)與該基因的轉(zhuǎn)錄以及病毒基因組DNA的復(fù)制動(dòng)態(tài)相一致。
　　 4、ORF4的N端蛋白在病毒粒子中的鑒定
　　 從感染BmPLV的病蠶蠶沙中純化病毒粒子,加熱使病毒粒子蛋白解聚,經(jīng)SDS-PAGE分離,以anti-ORF4-N,anti-P128和anti-POL分別對(duì)其進(jìn)行westernblot分析,結(jié)果顯示,以anti

8、-ORF4-N檢測(cè)病毒粒子蛋白,能夠觀察到兩條信號(hào)強(qiáng)的蛋白帶,表明ORF4的N端編碼的蛋白可能參與病毒粒子組成。
　　 5、ORF4在桿狀病毒MultiBac系統(tǒng)中的表達(dá)
　　 將病毒基因VD1-ORF4克隆到桿狀病毒穿梭載體pFBDM的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建pFBDM-ORF4重組轉(zhuǎn)移載體。轉(zhuǎn)化至受體菌DH10MultiBac獲得重組的Multibacmid-ORF4。重組的Multibacmid-ORF4轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Hi