油菜莖特異啟動子pSH4的克隆和分析及轉(zhuǎn)基因作物篩查質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、啟動子在基因表達調(diào)控中起關(guān)鍵性作用，它在很大程度上決定目的基因表達的時間、空間和強度。當前商業(yè)化應用的植物基因工程產(chǎn)品大多使用的是組成型啟動子，它們驅(qū)動外源基因在植物各種組織和所有發(fā)育階段表達，這無疑增加了植物的代謝負擔導致物質(zhì)和能量的浪費，另外可能引起影響植物生長發(fā)育的植物形態(tài)改變，并且組成型表達的篩選標記基因不利于轉(zhuǎn)基因安全。因此克隆組織特異表達啟動子對于提高轉(zhuǎn)基因效率及增加轉(zhuǎn)基因安全性有著重要的意義。油菜中目前研究最多的是種子表達

2、啟動子，已經(jīng)克隆了多個種子特異啟動子，而對油菜營養(yǎng)器官啟動子研究較少。本研究從油菜基因組中克隆莖部特異性表達基因啟動子pSH4，并與GFP報告基因融合，轉(zhuǎn)化擬南芥后對其進行功能的初步驗證，該研究的結(jié)果可以為油菜莖的基因特異表達提供有價值的啟動子。本研究的主要研究結(jié)果包括以下幾個方面：
　　 1、通過篩選擬南芥組織特異表達基因，篩選獲得6個莖特異表達基因。
　　 2、用甘藍型油菜中雙9號為材料，在盛花期取其根、莖、葉、花器

3、官等，提取RNA進行啟動子的各器官表達相對強度進行分析。結(jié)果顯示候選基因SH4呈在莖中特異性表達。
　　 3、檢索白菜基因組測序序列，獲得油菜SH4啟動子的序列，設(shè)計引物克隆了油菜莖特異性啟動子pSH4，長度1779bp。生物信息學分析顯示其具有多種順式作用元件，包括參與莖組織特異性表達的元件如CCA1ATLHCB1、DOFCOREZM等，激素誘導相關(guān)元件ASF1MOTIFCAMV、LTRECOREATCOR15等，以及物理因素

4、誘導的相關(guān)元件GT1CORE、GT1CONSENSUS等。
　　 4、為進一步驗證SH4的功能，成功構(gòu)建2個植物表達載體：pBI121-SH4-GFP，攜帶pSH4啟動子驅(qū)動GFP基因的表達盒，由農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，觀察T1代植株的GFP的表達情況，結(jié)果表明pSH4啟動子具有維管束組織表達特異性，是理想的莖表達啟動子。
　　 本研究對pSH4啟動子的分離和組織特異性及其序列特征的生物信息學、表達分布等方

5、面的分析，為深入研究和利用該啟動子提供了試驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 另外，本研究構(gòu)建一種轉(zhuǎn)基因作物通用陽性質(zhì)粒分子，為轉(zhuǎn)基因生物篩查檢測和安全監(jiān)管服務。通過分析全球商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物分子特征，選取常用的調(diào)控元件啟動子CaMV 35S、FMV35S、nos，終止子NOS 3'、T-35S、g7 3'、E9 3'，和標記基因bar、 NPT II、hpt II、pmi作為篩查靶標序列，通過重組PCR技術(shù)將這些元件克隆到雙元載體p

6、BI121上，構(gòu)建成包含11個轉(zhuǎn)基因元件的通用陽性質(zhì)粒分子pBI121-ELEMENTS。質(zhì)粒序列信息已提交至GeneBank并獲得序列號HM047294。該質(zhì)粒分子對目前國內(nèi)外批準的5類主要轉(zhuǎn)基因作物(大豆、油菜、玉米、棉花和水稻)理論篩查覆蓋率達到91.5[％]，對我國批準進口的27種轉(zhuǎn)基因作物的理論篩查覆蓋率達100[％]。以pBI121-ELEMENTS為陽性對照，篩查7個轉(zhuǎn)基因品系，結(jié)果顯示該分子能夠有效用于轉(zhuǎn)基因作物定性篩查