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文檔簡介
1、柑橘是世界上最重要的果樹之一。砧木是果樹的基礎,砧木的根系是影響接穗對營養(yǎng)、水分和無機鹽吸收的關鍵功能器官,同時,也是直接對抗土壤微生物、干旱、酸性和重金屬侵害的第一道防御系統(tǒng),因此,根對于植物的生長發(fā)育及其產(chǎn)量具有重要的生物學意義。目前,在擬南芥等模式植物中,根生長發(fā)育及代謝相關基因的研究已取得了較大進展,許多根特異表達的功能基因和調(diào)控序列已進行克隆和分析;而在柑橘中,相關研究報道很少。因此,開展柑橘根特異表達基因和調(diào)控序列的克隆和分
2、析對促進柑橘等果樹品種根部相關性狀的基因工程定向改良工作具有重要的研究價值,也是柑橘基因工程育種的熱點方向之一。
枳(Poncirustrifoliata)是我國主導砧木品種。本研究在枳根差減cDNA文庫中篩選出的unigenessingleton297和contig22與枳根全長cDNA文庫中的contig2完全匹配,利用生物信息學、分子生物學及轉(zhuǎn)基因技術對contig2進行了基因和啟動子的克隆及表達分析,主要結(jié)果如下:
3、
1、contig2組織表達分析
contig2與CitrusFunctionalGenomicsProject(CFGP)中登錄的23個EST具有高度序列同源性,這23個EST序列大多來源于柑橘根cDNA文庫。
以枳1月齡苗、6月齡苗、20年生成年樹的根和葉組織為材料,運用Real-TimePCR技術對contig2進行相對表達量分析,結(jié)果表明contig2在根中的表達量分別是葉中的的46.3
4、4、74.82、110.25倍,進一步說明contig2具有根特異性表達。
2、contig2基因特征
contig2核苷酸序列全長801bp,含1個內(nèi)含子(104bp)和2個外顯子。其開放閱讀框長471bp,3'端非翻譯區(qū)含加尾信號AATAAA。
3、contig2編碼蛋白特征
contig2編碼主要乳膠蛋白(majorlatexprotein,MLP),含bet_v_I功能域,
5、由156個氨基酸組成,分子量為17.63kDa,等電點為5.49。二級結(jié)構預測含3個α-螺旋和5個β-折疊,包含有的一個保守疏水基結(jié)合位點和一個富含甘氨酸的回環(huán)結(jié)構。
4、contig2啟動子的克隆與分析
通過1次同源克隆和2次YADE-PCR,獲得contig2的5'端上游1685bp調(diào)控序列。并運用PlantCARE軟件對該序列進行啟動子結(jié)構分析,在序列中發(fā)現(xiàn)有TATA-box、CAAT-box等一般啟動
6、子結(jié)構的核心元件,還具有CCAAT、as-2-box、CAT-box、MBS、TGACG-motif等特異性應答元件。
5、contig2啟動子表達特異性分析
以pBI121載體為骨架構建了含有contig2啟動子的植物表達載體pBI121-2P,利用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化枳上胚軸,抗性芽長出后進行生根培養(yǎng),共獲得21株轉(zhuǎn)基因苗。GUS染色結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因植株根比葉顯色深。選取5株轉(zhuǎn)基因苗進行Real-TimePCR,
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