馴鹿β-防御素-1(reBD-1)基因的原核表達(dá)及蛋白活性的鑒定.pdf

1、防御素（defensin）是生物體先天性免疫系統(tǒng)中的一類(lèi)短肽，是內(nèi)源性抗菌肽中的一個(gè)大家族。防御素具有廣譜的抗菌活性，無(wú)論在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外都可以直接殺死細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)某些惡性腫瘤細(xì)胞也有毒殺作用。β-防御素是防御素家族的重要成員之一，本文對(duì)馴鹿β-防御素的表達(dá)、分離純化及抗菌活性等方面展開(kāi)了初步研究。
　　本試驗(yàn)旨在構(gòu)建馴鹿β防御素-1（reindeerβ-defensin-1，reBD

2、-1）基因的原核表達(dá)載體 pET-32a（+）/reBD-1，誘導(dǎo) reBD-1融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼reBD-1前原肽基因。從重組克隆載體pMD-19T/reBD-1中擴(kuò)增 reBD-1成熟肽編碼序列，并克隆入 pET-32a（+）中，在大腸桿菌 BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá) reBD-1融合蛋白。表達(dá)的融合蛋白擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)一步純化后進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果

3、表明，編碼reBD-1前原肽和成熟肽的基因序列大小分別為225bp和138bp，目的基因的序列與reBD-1 mRNA序列同源性為100﹪。前原肽和成熟肽融合蛋白分子量分別為28KDa和24KDa。利用瓊脂糖擴(kuò)散法表明0.08 mg/ml的純化成熟肽蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的活性有明顯抵抗作用。結(jié)果顯示，reBD-1前原肽及成熟肽的融合蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。成熟肽融合蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌的活性有抗性，前原肽融合蛋白