pCMV6-XL4-Galc真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、[目的]
　　 構(gòu)建含半乳糖基神經(jīng)酰胺酶(Galc)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-XL4/Galc,檢測其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況,并探討Galc基因?qū)EK293細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 [方法]
　　 從胎盤組織提取總RNA,以此為模板,并設(shè)計(jì)帶有EeoRⅠ和SalⅠ雙酶切位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR,擴(kuò)增出目的基因片段,經(jīng)回收、純化后連接到真核表達(dá)質(zhì)粒載體pCMV6-XL4上,再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH

2、5α工程菌擴(kuò)增,利用載體的Amp抗性基因進(jìn)行初篩,陽性克隆行酶切鑒定及測序鑒定。將鑒定好的陽性重組質(zhì)粒pCMV6-XL4/Galc用Lipofectamine(TM)2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,同時設(shè)未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染pCMV6-XL4空質(zhì)粒組為對照。轉(zhuǎn)染48h后利用RT-PCR方法檢測Galc基因mRNA在HEK293細(xì)胞中的表達(dá),利用免疫細(xì)化和Western blot方法檢測Galc蛋白的表達(dá);以四氮唑鹽(MTT)法及流式細(xì)胞術(shù)(

3、FCM)分別檢測Galc基因?qū)EK293細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)重組質(zhì)粒pCMV6-XL4/Galc經(jīng)酶切后電泳,獲得約為4.7kb的載體片段和3.8kb的目的片段,測序分析表明插入的片段與GenBank發(fā)布的序列一致。
　　 (2)轉(zhuǎn)染48h后,RT-PCR及免疫細(xì)化結(jié)果顯示,pCMV6-XL4/Galc重組質(zhì)粒組可見目的基因mRNA及蛋白的表達(dá),而未轉(zhuǎn)染組及pCMV6-XL4空質(zhì)

4、粒組幾乎未見Galc基因的表達(dá)。
　　 (3)與未轉(zhuǎn)染組及pCMV6-XL4空質(zhì)粒組相比較,pCMV6-XLA/Galc重組質(zhì)粒組HEK293細(xì)胞的MTT結(jié)果顯示細(xì)胞增殖受到明顯抑制,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果則顯示該組細(xì)胞凋亡明顯增加,而未轉(zhuǎn)染組及pCMV6-XL4空質(zhì)粒組相比較則無明顯差異。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)成功構(gòu)建了pCMV6-XL4/Galc真核表達(dá)質(zhì)粒;
　　 (2)成功將Galc基因轉(zhuǎn)染進(jìn)HE