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文檔簡介
1、重組蛋白藥物在市場中需求量越來越大。哺乳動物細(xì)胞能夠進(jìn)行復(fù)雜的翻譯后加工修飾使蛋白產(chǎn)物更接近天然構(gòu)象,從而在各種重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中占據(jù)優(yōu)勢地位。近來,瞬時基因表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展迅速,通過瞬時表達(dá)可以快速的獲取大量的高活性重組蛋白。本研究的策略是通過摸索HEK2936E懸浮細(xì)胞的無血清瞬時轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染方法,并通過Fed-Batch方式補(bǔ)料維持細(xì)胞良好狀態(tài)來達(dá)到提高瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)量。
本研究以綠色熒光蛋白GFP、嵌合抗體10F7 cAb為
2、報告基因來評價轉(zhuǎn)染和補(bǔ)料等條件對瞬時表達(dá)產(chǎn)量的影響;以人源化抗體E6F6 hAb、嵌合抗體129G1cAb、嵌合抗體5F9 cAb為報告基因來評價信號肽改造、密碼子優(yōu)化對瞬時表達(dá)產(chǎn)量的影響。HEK2936E細(xì)胞無血清轉(zhuǎn)染優(yōu)化條件包括培養(yǎng)基、真核載體、DNA/PEI比例、細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染方法等等。經(jīng)過優(yōu)化后在4×106 cells/ml細(xì)胞密度下以PEI為轉(zhuǎn)染試劑,pTT5為表達(dá)載體,DNA/PEI為1/8條件下轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到60%
3、以上,10F7cAb產(chǎn)量可由初始40mg/L提高至313mg/L。而采用DOP轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率可到70%以上,10F7cAb產(chǎn)量可達(dá)400mg/L。
為改善細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的表達(dá)條件及提高表達(dá)水平,本研究采用Fed-Batch的方式添加營養(yǎng)物質(zhì),營養(yǎng)物質(zhì)包括動物蛋白水解物,丁酸鈉,維生素B12,檸檬酸鐵,F(xiàn)M補(bǔ)料培養(yǎng)基等。這些營養(yǎng)物質(zhì)對目的蛋白的產(chǎn)量提高效果不盡相同,提高范圍從15%至35%,最高表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)553mg/L。本
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