HEK293 6E細胞瞬時基因表達平臺的建立及應用.pdf

1、重組蛋白藥物在市場中需求量越來越大。哺乳動物細胞能夠進行復雜的翻譯后加工修飾使蛋白產(chǎn)物更接近天然構(gòu)象，從而在各種重組蛋白表達系統(tǒng)中占據(jù)優(yōu)勢地位。近來，瞬時基因表達系統(tǒng)發(fā)展迅速，通過瞬時表達可以快速的獲取大量的高活性重組蛋白。本研究的策略是通過摸索HEK2936E懸浮細胞的無血清瞬時轉(zhuǎn)染條件和轉(zhuǎn)染方法，并通過Fed-Batch方式補料維持細胞良好狀態(tài)來達到提高瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)量。
　　 本研究以綠色熒光蛋白GFP、嵌合抗體10F7 cAb為

2、報告基因來評價轉(zhuǎn)染和補料等條件對瞬時表達產(chǎn)量的影響;以人源化抗體E6F6 hAb、嵌合抗體129G1cAb、嵌合抗體5F9 cAb為報告基因來評價信號肽改造、密碼子優(yōu)化對瞬時表達產(chǎn)量的影響。HEK2936E細胞無血清轉(zhuǎn)染優(yōu)化條件包括培養(yǎng)基、真核載體、DNA/PEI比例、細胞密度、轉(zhuǎn)染方法等等。經(jīng)過優(yōu)化后在4×106 cells/ml細胞密度下以PEI為轉(zhuǎn)染試劑，pTT5為表達載體，DNA/PEI為1/8條件下轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率可以達到60％

3、以上，10F7cAb產(chǎn)量可由初始40mg/L提高至313mg/L。而采用DOP轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率可到70％以上，10F7cAb產(chǎn)量可達400mg/L。
　　 為改善細胞轉(zhuǎn)染后的表達條件及提高表達水平，本研究采用Fed-Batch的方式添加營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)包括動物蛋白水解物，丁酸鈉，維生素B12，檸檬酸鐵，F(xiàn)M補料培養(yǎng)基等。這些營養(yǎng)物質(zhì)對目的蛋白的產(chǎn)量提高效果不盡相同，提高范圍從15％至35％，最高表達產(chǎn)量可達553mg/L。本