蒙古綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤屏障的重要組成成分，對胚胎的植入過程起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究旨在進(jìn)行體外培養(yǎng)、鑒定蒙古綿羊滋養(yǎng)層細(xì)胞（trophoblastic cells），并對其生物學(xué)特征進(jìn)行探究，來建立一種能穩(wěn)定、方便地獲得較高純度的綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，為后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和RNA干擾試驗提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　經(jīng)過培養(yǎng)不同孕期（早、中、晚）的蒙古綿羊滋養(yǎng)層細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胎盤的采集時間對細(xì)胞的貼壁率及細(xì)胞活性影響較大，確定采集胎盤的最佳時期為

2、孕中期。通過添加不同濃度的血清，篩選出含15％胎牛血清(Fetal Bovine Serum FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)體系較適合細(xì)胞生長。細(xì)胞培養(yǎng)初期，通過胰酶消化差速法，去除上皮樣細(xì)胞中混雜的成纖維狀細(xì)胞，并在5代之內(nèi)得到純化的細(xì)胞。應(yīng)用伊紅-蘇木素染色法（HE），可觀察到純化的細(xì)胞形態(tài)多樣，呈多角形或卵圓形，細(xì)胞界限清楚，胞漿透明，核圓或呈小泡狀。使用免疫組織化學(xué)方法，分別檢測不同孕期的正常綿羊胎盤絨毛組織，以及體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)

3、胞，結(jié)果顯示，培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞中細(xì)胞角蛋白呈陽性表達(dá)，波形蛋白呈陰性表達(dá)，證明細(xì)胞的純度在90%以上，符合后續(xù)實驗的要求純度。應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，觀察結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的細(xì)胞具有滋養(yǎng)層細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體較多，并可見電子密度較高的脂滴，細(xì)胞核較大，細(xì)胞間可見縫隙連接結(jié)構(gòu)，提示所培養(yǎng)細(xì)胞為綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞。利用RT-PCR技術(shù)檢測滋養(yǎng)層蛋白-1，結(jié)果顯示，純化的細(xì)胞能夠表達(dá)滋養(yǎng)層