豬鏈球菌2型oct缺失株的構(gòu)建及OCT蛋白的免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、豬鏈球菌是主要的一種人畜共患病原菌，在自然界中分布廣泛。該病原菌不僅引起豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎及心內(nèi)膜炎等，而且還可感染人，給相關(guān)從業(yè)者的生命安全造成一定程度的威脅。根據(jù)豬鏈球菌莢膜多糖抗原結(jié)構(gòu)可以將其分為33個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型致病性最強(qiáng)，流行性最廣，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的危害最大。近年來對(duì)SS2毒力因子的研究越來越多，但是各毒力因子間的相互作用、與疾病發(fā)展的關(guān)系及SS2的致病機(jī)理還不明確，以至于給該病的診斷，治療和預(yù)防帶了困

2、難。
　　鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶（Orinithine Carbamoyl Transferase，OCT）是精氨酸脫亞胺酸酶（Arginine Deiminase System，ADS）系統(tǒng)中不可缺少的一種酶，而ADS在宿主體內(nèi)可以使微生物逃避免疫系統(tǒng)的作用。其可以代謝精氨酸為細(xì)菌提供ATP和生長繁殖所必需的瓜氨酸等物質(zhì)。在無乳鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌中 OCT都作為重要的免疫原性蛋白被鑒定出來。Wintethoff等通過 DNA雜交技

3、術(shù)證明OCT也存在于豬鏈球菌2型和9型中。但對(duì)于豬鏈球菌2型中OCT相關(guān)功能的研究并不多見。因此，本研究主要針對(duì)豬鏈球菌2型ZY05719菌株的oct基因進(jìn)行研究。
　　1.豬鏈球菌2型ZY05719株oct基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　利用同源重組系統(tǒng)構(gòu)建ZY05719株的oct基因缺失株，并對(duì)其生長速度、生物被膜形成、致病力以及對(duì)PK-15細(xì)胞的黏附入侵等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，oct基因缺失后對(duì)豬鏈球菌生

4、物被膜形成能力與親本相比無明顯變化。致病力僅僅下降了2.9倍，與野生株毒力差異不明顯。其生長速度在4~10h期間低于野生株，8h后無明顯變化。在缺失oct細(xì)胞黏附侵襲能力比親本株降低約35.4％。2.豬鏈球菌2型ZY05719株oct基因的原核表達(dá)
　　克隆出ZY05719菌株的oct的基因，構(gòu)建pET28a-oct原核表達(dá)質(zhì)粒并在大腸桿菌 Rosetta中進(jìn)行表達(dá)。然后分別用SDS-PAGE和Western-bloting對(duì)蛋白

5、進(jìn)行鑒定分析。以上結(jié)果表明通過原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)出了 OCT融合蛋白，并且該蛋白具有良好免疫反應(yīng)原性。并探討了OCT蛋白對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成的影響及介導(dǎo)豬鏈球菌粘附 PK-15細(xì)胞中的作用。發(fā)現(xiàn) OCT蛋白能提高豬鏈球菌形成生物被膜的能力及能降低粘附PK-15細(xì)胞的作用。為進(jìn)一步研究OCT蛋白抗原結(jié)構(gòu)域的免疫原性及研制豬鏈球菌亞單位疫苗奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.小鼠的免疫效果評(píng)價(jià)
　　用純化的OCT蛋白充分乳化來

6、免疫CD1小鼠，評(píng)估免疫保護(hù)作用，并和豬鏈球菌2型全菌活疫苗進(jìn)行比較。分別在首免7天、14天后采血。并加強(qiáng)免疫1次，采血兩次，并在每次免疫后采血測抗體效價(jià)。在最后一次免疫的第14天，用5×107CFU(5LD50)致死劑量的SS2強(qiáng)毒株ZY05719給CD1小鼠攻毒，然后觀察小鼠攻毒后的情況。結(jié)果顯示 OCT蛋白免疫組62.5%的小鼠存活。OCT蛋白免疫組的小鼠各器官細(xì)菌含量顯著低于空白組（p<0.05）。OCT蛋白免疫組的特異性抗體都