中華鱉虹彩病毒(STIV)全基因組序列測(cè)定、注釋及虹彩病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，虹彩病毒已成為嚴(yán)重威脅著世界各地水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的致病性病原之一，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。中華鱉虹彩病毒(Soft-shelled turtleiridovirus，STIV)是一種從患“紅脖子病”的養(yǎng)殖中華鱉體內(nèi)分離到的重要病毒性病原；石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是一種從重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類-石斑魚(yú)中分離的病毒性病原。為了更好地理解虹彩病毒的致病機(jī)理，為抗病毒對(duì)策的

2、開(kāi)展提供信息，我們利用454測(cè)序技術(shù)獲得了STIV基因組全序列；分析了基因組的結(jié)構(gòu)特征及進(jìn)化地位；同時(shí)我們還比較研究了STIV和SGIV誘導(dǎo)魚(yú)類細(xì)胞死亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果簡(jiǎn)述如下：
　　 (1)，測(cè)定STIV的基因組全序列。其基因組全長(zhǎng)為105890bp，與虹彩病毒科蛙病毒屬代表種FV3的全基因組有98.5％的同源性，G+C含量為55.1％。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明；其編碼區(qū)含有105個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading fram

3、e，ORF)，其中有42個(gè)ORFs和其他物種已鑒定基因具有一定的同源性；49個(gè)ORFs儀僅在虹彩病毒科成員中具有類似物；還有14個(gè)ORFs為未知基因。
　　 (2)，分析STIV在虹彩病毒科中的進(jìn)化地位。首先通過(guò)對(duì)四個(gè)核心基因，包括主要衣殼蛋白、RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，十四烷基化膜蛋白，以及核糖核酸酶Ⅲ進(jìn)行進(jìn)化發(fā)育樹(shù)分析，高度一致的結(jié)果表明STIV在進(jìn)化地位上和FV3關(guān)系最近。進(jìn)一步選擇脊椎動(dòng)物虹彩病毒進(jìn)行全基因組核苷酸進(jìn)化發(fā)

4、育分析，結(jié)果表明與FV3在進(jìn)化關(guān)系上最近的是來(lái)源于爬行動(dòng)物的病毒STIV，而不是同樣來(lái)源于兩棲類動(dòng)物的TFV。同時(shí)我們選擇虹彩病毒的11個(gè)核心基因氨基酸序列拼接后構(gòu)建進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，分析虹彩病毒在進(jìn)化過(guò)程中的基因獲得與丟失事件，結(jié)果揭示隨著宿主的進(jìn)化，虹彩病毒在進(jìn)化過(guò)程中一直伴隨著基因的獲得與丟失，并且宿主的物種進(jìn)化程度越高，病毒獲得與丟失基因的事件越少。
　　 (3)，利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、TUNEL染色、caspase活性

5、測(cè)定等技術(shù)，研究STIV體外感染誘發(fā)魚(yú)類細(xì)胞死亡的特征。STIV感染后細(xì)胞變圓脫落、細(xì)胞核皺縮，形成凋亡小體。而且TUNEL染色呈陽(yáng)性，同時(shí)伴隨著caspase-3和caspase-9的激活。進(jìn)一步的分析表明，STIV感染伴隨著線粒體膜電勢(shì)降低，細(xì)胞色素C的釋放以及活性氧的增加。以上結(jié)果揭示STIV感染誘導(dǎo)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 (4)，結(jié)合免疫熒光觀察和Western blot檢測(cè)，比較了STIV和SGIV感染誘導(dǎo)魚(yú)

6、類程序性細(xì)胞死亡過(guò)程中的MAPK信號(hào)途徑激活情況。盡管兩種虹彩病毒感染都能導(dǎo)致ERK、p38MAPK和JNK信號(hào)分子的磷酸化，但對(duì)三種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活形式及上下游效應(yīng)因子的激活情況有所差別。明顯的區(qū)別在于，STIV激活ERK磷酸化呈雙階段，而SGIV在感染的早期激活ERK；STIV感染能夠激活A(yù)TF-2發(fā)生磷酸化，在SGIV感染的過(guò)程中，檢測(cè)不到ATF-2的磷酸化。此外，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑特異性抑制劑能夠降低STIV的復(fù)制，但是JN