人溶菌酶融合基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、人溶菌酶(human lysozyme,HLY)是人體液和組織中一種重要的防御因子,它具有抗菌、消炎、促進(jìn)組織修復(fù)和增強(qiáng)免疫力等多種藥理作用。在醫(yī)學(xué)臨床中,人溶菌酶生物源性和蛋白質(zhì)本身特點(diǎn)使得其在低毒性和抗耐藥性等方面更顯優(yōu)勢(shì),為臨床用藥提供了新的選擇。
　　 由于人溶菌酶只能從乳汁、胎盤等體液和組織中少量提取,而且分離純化成本較高,無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。因而人溶菌酶的廣泛應(yīng)用只能通過(guò)生物技術(shù)手段才得以實(shí)現(xiàn)。目前國(guó)內(nèi)外研究工作者已

2、經(jīng)利用多種表達(dá)載體在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)人溶菌酶,其中以大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究最多。
　　 為了平衡人溶菌酶分子的正電荷,降低其對(duì)宿主細(xì)胞的毒性,本研究擬將其分別與陰離子肽(AP)以及木聚糖酶(Xyn)融合,中間插入腸激酶位點(diǎn)(Eksite)或者柔性的連接肽(Linker),使表達(dá)的融合蛋白起始以無(wú)活性或弱活性形式分泌到畢赤酵母胞外,再在體外經(jīng)腸激酶酶切釋放出具有生物活性的人溶菌酶和木聚糖酶。
　　 研究結(jié)果如下

3、:①選取人β防御素-25原片段的部分序列作為陰離子肽,根據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)并合成該段基因,設(shè)計(jì)時(shí)在基因中引入了His-tag和腸激酶酶切位點(diǎn)。構(gòu)建了陰離子肽-人溶菌酶融合基因的真核表達(dá)載體,在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。然而經(jīng)蛋白質(zhì)電泳分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組菌表達(dá)的蛋白分子量約為38.1kD,遠(yuǎn)高于理論值21.7kD;②設(shè)計(jì)特定的引物序列將木聚糖酶和人溶菌酶基因相連接,中間分別插入腸激酶酶切位點(diǎn)和柔性的連接肽,構(gòu)建了木聚糖酶-Eksite

4、-人溶菌酶以及木聚糖酶-Linker-人溶菌酶融合基因,并在畢赤酵母中表達(dá)。蛋白質(zhì)電泳結(jié)果顯示,重組蛋白得到了表達(dá);采用改良舒加法和DNS法分別測(cè)定發(fā)酵液上清的溶菌酶活性和木聚糖酶活性,其中木聚糖酶-Linker-人溶菌酶融合蛋白的溶菌酶活性為180U/ML,略高于木聚糖酶-Eksite-人溶菌酶融合蛋白170U/ML;木聚糖酶活性則相反,分別為158U/ML和185U/ML。經(jīng)超濾濃縮、Sephadex G-75凝膠層析分離純化,得到