魚類P450誘導劑和抑制劑在草魚體內(nèi)外對雙氟沙星N-脫甲基化代謝的影響.pdf

1、細胞色素P450(CYP)是動物體內(nèi)代謝藥物的重要的酶。CYP1A、3A和2E的誘導和抑制作用己被廣泛研究，其誘導劑和抑制劑已經(jīng)比較明了，但關于魚類P450誘導劑和抑制劑對雙氟沙星N-脫甲基化影響的研究卻未見報道。本文采用RP-HPLC的方法研究了魚類P450的典型誘導劑和抑制劑對雙氟沙星N-脫甲基化影響，預測了參與雙氟沙星N-脫甲基化代謝的主要的P450酶。本論文的研究內(nèi)容分為五章：第一章是草魚肝和腎中雙氟沙星和沙拉沙星共檢出方法的比

2、較研究；第二章是魚類誘導劑和抑制劑在體外對雙氟沙星N-脫甲基化的作用；第三章是魚類誘導劑和抑制劑在體內(nèi)對雙氟沙星N-脫甲基化的作用：第四章是雙氟沙星對草魚肝和腎組織的損傷模型的初步建立；第五章是實驗用魚的多功能口服給藥裝置的專利申請。主要內(nèi)容如下：
　　 1草魚肝和腎中雙氟沙星和沙拉沙星共檢出方法的比較研究
　　 以草魚肝和腎組織為研究對象，比較了反相高效液相色譜法測定同時測定雙氟沙星和沙拉沙星的內(nèi)標法和外標法。外標法和

3、內(nèi)標法(以諾氟沙星為內(nèi)標)均采用有機溶劑二氯甲烷提取樣品中的藥物，45℃吹干，流動相溶解，正已烷去脂，反相高效液相色譜法測定其中的藥物濃度。利用外標法測得DIF的平均回收率在肝和腎中分別為82.41％和82.13％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.79％和4.92％；SAR的平均回收率在肝和腎中分別為82.02％和81.94％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.96％和5.06％；利用內(nèi)標法測得DIF的平均同收率在肝和腎中分別為82.32％和

4、82.17％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.92％和4.73％：SAR的平均回收率在肝和腎中分別為82.06％和82.13％，各樣品日內(nèi)變異系數(shù)分別小于4.92％和4.52％。外標法測得肝中DIF和SAR的LOD為0.01和0.02μg·g-1，腎中DIF和SAR的LOD為0.02和0.05μg·g-1，肝和腎中DIF和SAR的LOQ均為0.05μg·g-1：內(nèi)標法測得肝中DIF和SAR的LOD均為0.02μg·g-1，腎中DIF和SA

5、R的LOD為0.02和0.05μg·g-1，肝和腎中DIF和SAR的LOQ均為0.05μg·g-1。綜合內(nèi)標法和外標法的優(yōu)缺點和上述實驗結果，本實驗選擇外標法檢測肝和腎組織中雙氟沙星和沙拉沙星的含量。
　　 2雙氟沙星對草魚肝細胞和腎細胞的毒性實驗
　　 細胞的傳代培養(yǎng)、凍存與復蘇采用實驗室常規(guī)的方法。細胞中蛋白含量檢測采用Lowry法，肝細胞中蛋白濃度為0.39mg/ml細胞，腎巾蛋白濃度為0.35mg/ml細胞。采用

6、MTT法分析了雙氟沙星在濃度分別為3.9、7.81、15.6、31.25、62.5、125、250、500和1000μM，對草魚肝細胞和腎細胞分別作用1h、2h、6h、12h、24h和48h之后，其結果表明肝細胞和腎細胞中選擇DIF濃度為3.9～125μM和細胞孵育的時間為1～6h，作為后續(xù)優(yōu)化DIF N-脫甲基化代謝研究的最高非致死濃度，為進一步研究雙氟沙星在肝和腎細胞中最佳代謝時間和濃度提供依據(jù)。
　　 3魚CYP誘導劑在草

7、魚肝細胞和腎細胞中對雙氟沙星N-脫甲基的作用
　　 為獲得有關CYP誘導的信息，本研究采用RP-HPLC的方法在GCL和CIK細胞中測定了CYP(s)的特異性誘導劑對DIF的代謝作用及酶動學分析。GCL的BNF處理組導致了DIF代謝水平5.1倍增加，而RIF處理組引起DIF代謝水平2.5倍增加，EA處理組對DIF代謝水平?jīng)]有明顯改變，BNF誘導組和對照組的酶動學方程分別為1/V=0.0157×1/[S]+0.001和1/V=0.

8、0673×1/[S]+0.0029，與對照相比，BNF導致Vmax1.9倍增加，Clint3.3倍增加。而在CIK中，DIF與經(jīng)BNF處理的CIK共孵育后，DIF的N-脫甲基化代謝水平有3倍增加，BNF誘導組和對照組的酶動學方程分別為1/V=0.0245×1/[S]+0.0013和1/V=0.1375×1/[S]+0.003,酶動學參數(shù)Clint和Vmax值分別增加了6倍和2倍，EA和RIF誘導組均使對Clint和Vmax值改變很小。B

9、NF是魚類CYP1A的特異性誘導劑，RIF是魚類CYP3A的強的誘導劑，因此，在本研究條件下，CYP1A和3A參與了GCL的DIF N-脫甲基化代謝，CYP1A參與了CIK中DIF的N-脫甲基化代謝。
　　 4魚類誘導劑和抑制劑在體內(nèi)對雙氟沙星N-脫甲基化的作用
　　 通過用魚類典型的誘導劑BNF(CYP1A)、EA(CYP2E)和RIF(CYP3A)和強抑制劑ANF(CYP1A), EF(CYP2E)和KTZ(CYP3

10、A)對DIF N-脫甲基化的作用。采用RP-HPLC方法檢測DIF的代謝產(chǎn)物SAR的產(chǎn)量，間接反應CYP酶對組織樣品中DIF-脫甲基化活性。SAR的生成量表明，在草魚的肝和腎中，ANF和BNF組在第三天時分別達到最大抑制和誘導，BNF誘導組的誘導率和ANF的抑制率高于25％。EA、EF、RIF和KTZ處理草魚，抑制和誘導率低于20％。酶動學參數(shù)表明，在腎中BNF引起Vmax和Clint0.56和0.38倍增加，而在肝中BNF引起Vmax

11、和Clint兩者都有1倍增加，EA和RIF處理組的Vmax和Clint與對照相比，差異不顯著。在肝和腎中，ANF預處理的DIF脫甲基化抑制的Lineweaver-Burk plot表明了混合類型的抑制，而EF和KTZ沒有顯示對DIF脫甲基化的抑制效應。ANF對魚腎中DIF的代謝的抑制常數(shù)(Ki)為12.9mg/kg體重，而ANF對魚肝中DIF的代謝的抑制常數(shù)(Ki)為12.53mg/kg體重。綜上，由于BNF和ANF分別為CYP1A的誘

12、導劑和抑制劑，CYP1A參與了草魚肝和腎中的DIF的N-脫甲基化。
　　 5雙氟沙星對草魚肝和腎組織的損傷模型的初步建立
　　 有些藥物或毒物可通過許多方式對肝臟和腎臟造成損害。喹諾酮類藥物對魚類組織損傷模型未見報道，本實驗研究了雙氟沙星對草魚肝臟和腎臟組織損傷的具體組織病理學變化。給草魚連續(xù)灌20mg/kg的雙氟沙星20天后，在觀察癥狀和剖檢變化后，以后對存活的魚取其肝臟組織和腎臟組織，進行石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀

13、察。眼觀無病變，顯微病變?yōu)楦闻K毛細血管充血，肝細胞出現(xiàn)空泡變性或玻璃樣變性。腎臟有出血，腎曲小管組織溶解，機化或化生，腎小球的細胞核腫脹。雙氟沙星對草魚肝和腎組織的損傷模型的初步建立為探知肝臟和腎臟疾病的病因、病理等提供有力的工具。
　　 6實驗用魚的多功能口服給藥裝置的專利設計
　　 給魚灌藥的過程中，現(xiàn)存管制裝置容易使胃腸液和液體漁藥溢出，并且末端容易損傷魚的腸胃。針對這些難題，設計了一實用新型專利。已獲得專利受理申