熱應(yīng)激心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110表達(dá)有其抗熱應(yīng)激性損傷機(jī)理研究.pdf

1、過高或過低的養(yǎng)殖環(huán)境溫度、生畜禽因貿(mào)易需要而長途運(yùn)輸?shù)纫蛩爻?dǎo)致畜禽發(fā)生應(yīng)激，導(dǎo)致應(yīng)激性損傷、肉品品質(zhì)降低、甚至死亡等，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對應(yīng)激及其應(yīng)激損傷展開研究并提出合理的降低應(yīng)激損傷對養(yǎng)殖業(yè)造成危害的措施尤為必要。熱休克蛋白(Hsp)是廣泛存在于從酵母菌至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一類具有保護(hù)作用的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，在生理?xiàng)l件或應(yīng)激條件下，能在有機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)大量、穩(wěn)定表達(dá)，是應(yīng)激條件下組織細(xì)胞生存必不可缺的分子伴侶。Hs

2、p110是熱休克蛋白家族中的重要一員，能保護(hù)應(yīng)激損傷的細(xì)胞或目的蛋白，而且高誘導(dǎo)表達(dá)的Hsp110能精確識(shí)別變性蛋白并使之保持在一個(gè)穩(wěn)定、可溶的狀態(tài)，使變性蛋白恢復(fù)至具有活性的狀態(tài)。因此，對熱應(yīng)激過程中Hsp110的研究也是熱休克蛋白家族研究中的一個(gè)重要方向，同時(shí)心肌細(xì)胞損傷也是導(dǎo)致應(yīng)激動(dòng)物猝死的可能原因之一。本文主要通過對體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立體外心肌細(xì)胞熱應(yīng)激模型，觀察熱應(yīng)激過程中心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110及其相

3、應(yīng)hsp110mRNA的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄、Hsp110變化規(guī)律與熱應(yīng)激心肌細(xì)胞損傷之間的相關(guān)性，探討Hsp110在熱應(yīng)激過程中抗應(yīng)激性損傷的保護(hù)作用與機(jī)制。
　　 運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞爬片技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、組織學(xué)技術(shù)及MTT試驗(yàn)等手段對原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行條件優(yōu)化。結(jié)果表明，取2日齡SD乳大鼠心臟，依次經(jīng)過膠原酶Ⅰ消化14 h，吹打7～9次，細(xì)胞差速貼壁60 min，加入0.1～0.3 MBRDU，逐點(diǎn)鋪細(xì)胞等過程，使免疫熒

4、光試驗(yàn)細(xì)胞鋪板總數(shù)為1.8～2.0×106個(gè)/mL，Western blot試驗(yàn)細(xì)胞鋪板總數(shù)為2.2～2.3×106個(gè)/mL，MTT試驗(yàn)細(xì)胞鋪板總數(shù)為0.25～1×106個(gè)/mL時(shí)，體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度可達(dá)到94％，滿足試驗(yàn)要求。而逐點(diǎn)鋪細(xì)胞等是獲得高純度體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的必要條件。
　　 將大鼠原代心肌細(xì)胞在37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行72 h的適應(yīng)性培養(yǎng)后，迅速將心肌細(xì)胞置于預(yù)熱的42℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，分別進(jìn)行0min

5、、10 min、20 min、40 min、60 min、120 min、240 min、360 min及480 min的熱應(yīng)激處理，應(yīng)用組織學(xué)、心肌特異性酶檢測技術(shù)、免疫熒光檢測技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)和Western blot檢測技術(shù)對熱應(yīng)激處理心肌細(xì)胞出現(xiàn)的應(yīng)激性損傷及保護(hù)性蛋白Hsp110變化規(guī)律進(jìn)行相關(guān)性分析研究。熱應(yīng)激心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、LDH、CK的酶活性顯著升高，表明心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)生了改變;組織學(xué)檢測結(jié)果顯示

6、，熱應(yīng)激40～60 min期間，心肌細(xì)胞體積急性腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量紅色變性顆粒，細(xì)胞核深染、濃縮;Westernblot檢測結(jié)果顯示，熱應(yīng)激處理20 min后，Hsp110的表達(dá)量呈顯著上升趨勢，并且在熱應(yīng)激處理240 min后，Hsp110的表達(dá)量比對照組提高約1.2倍;免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，顆粒狀Hsp110分布于心肌細(xì)胞的胞漿與細(xì)胞核內(nèi)，42℃熱應(yīng)激240 min后，核內(nèi)Hsp110的分布密度顯著增加;hsp110mRNA在熱應(yīng)

7、激處理20 min后也明顯增加，并于240 min時(shí)達(dá)到高峰，增加量約為對照組的10倍。研究結(jié)果表明，Hsp110在體外培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)對熱應(yīng)激敏感，在基因和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)出表達(dá)量的明顯增加，可能參與心肌細(xì)胞獲得熱耐受過程，在心肌細(xì)胞對抗或減輕熱應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用。
　　 將大鼠原代心肌細(xì)胞在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行72 h的適應(yīng)性培養(yǎng)，迅速將心肌細(xì)胞置于預(yù)熱的42℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別進(jìn)行0 min、1

8、0 min、20 min、40 min、60 min、120 min、240 min、360 min及480 min的熱應(yīng)激處理。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，陽性染色Hsp110顆粒主要位于胞漿內(nèi)，胞核內(nèi)也有少量分布，在熱應(yīng)激4h后，陽性染色Hsp110顆粒在細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)均大量增加。不同于Hsp110的是，應(yīng)激組與對照組心肌細(xì)胞內(nèi)的HSF-1僅分布在細(xì)胞核內(nèi);在42℃熱應(yīng)激120 min后，應(yīng)激心肌細(xì)胞內(nèi)hsp110 mRNA的轉(zhuǎn)錄量增加

9、，同時(shí)可見Hsp110表達(dá)量也顯著增加，而且，同一時(shí)期內(nèi)HSF-1的表達(dá)量也增加。結(jié)果表明，Hsp110與HSF-1表達(dá)與分布具有時(shí)間依賴的方式，且對熱敏感。熱應(yīng)激期間Hsp110表達(dá)增加以及HSF-1的表達(dá)先下降后升高的特點(diǎn)，表明二種蛋白在心肌細(xì)胞熱損傷的保護(hù)中發(fā)揮著不同的作用。
　　 用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)對離體培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行熱應(yīng)激，對熱應(yīng)激心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110表達(dá)與線粒體凋亡信號(hào)通

10、路以及核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）主要調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在熱應(yīng)激處理1h內(nèi)，NAC顯著抑制了熱應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而且隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長，這種抑制作用呈現(xiàn)減弱的趨勢;NAC對熱應(yīng)激心肌細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路的調(diào)節(jié)蛋白NF-κB具有顯著的抑制效果。
　　 將體外37℃條件下適應(yīng)性培養(yǎng)48 h的心肌細(xì)胞利用Hsp siRNA與脂質(zhì)體Lipofectamine2000進(jìn)行24 h轉(zhuǎn)染，采用棄掉轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物溶液和保留轉(zhuǎn)

11、染試劑復(fù)合物溶液二種方法進(jìn)行Hsp110基因沉默，然后在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至84 h，分別在24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h收獲細(xì)胞，對Hsp110 siRNA引物沉默大鼠原代心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110基因表達(dá)與轉(zhuǎn)染方式、沉默時(shí)間及培養(yǎng)基中血清之間相互關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果表明，棄掉轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物溶液后，陰性對照組及試驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110的相對表達(dá)量在36～48 h達(dá)峰值，然后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，36～72 h

12、內(nèi)的沉默效率為40％左右，84 h時(shí)的沉默效率為82％;保留轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物溶液后，陰性對照組心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110的相對表達(dá)量在72 h達(dá)到峰值，然后逐漸下降，試驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110的相對表達(dá)量在36h時(shí)達(dá)到峰值，然后呈逐漸下降趨勢，在84 h時(shí)最低，72～84 h的沉默效率在86％～95％。這一結(jié)果說明，轉(zhuǎn)染試劑以及siRNA對轉(zhuǎn)染效率及沉默效率是有顯著影響的，而且，我們合成的Hsp110 siRNA引物在40～120nM時(shí)，轉(zhuǎn)

13、染試劑siRNA復(fù)合體對細(xì)胞持續(xù)轉(zhuǎn)染72～84 h，獲得的對心肌細(xì)胞Hsp110表達(dá)的沉默效率最佳。
　　 用Hsp110 siRNA引物轉(zhuǎn)染并沉默體外37℃培養(yǎng)48 h的心肌細(xì)胞，37℃繼續(xù)培養(yǎng)60 h后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，改用含15％ FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h;然后于42℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行4h的熱應(yīng)激處理，采用Western blot、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)等檢測技術(shù)，對體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110

14、相對表達(dá)量的變化、心肌細(xì)胞相關(guān)酶AST、CK、CK-MB、LDH的改變以及心肌細(xì)胞凋亡變化進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，Hsp110 siRNA引物轉(zhuǎn)染并沉默體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞后，經(jīng)過4h的熱應(yīng)激處理后，試驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp110的相對表達(dá)量顯著下降;心肌特異性酶AST、CK、CK-MB在細(xì)胞培養(yǎng)液中的含量升高，但差異不顯著;心肌細(xì)胞早、晚期凋亡減少，但差異不顯著。這一結(jié)果說明，Hsp110在持續(xù)性熱應(yīng)激過程中的所呈現(xiàn)的變化與以往的報(bào)道有