豬D型多殺性巴氏桿菌毒素分段基因的原核表達(dá)及表達(dá)重組蛋白免疫學(xué)特異性的初步研究.pdf

1、產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌（T?Pm,Toxigenic Pasteurella multocida）是引起豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎（PAR,Progressive atrophic rhinitis）重要致病因子，PAR作為一種進(jìn)行性的呼吸道疾病，在臨床上會(huì)引起育肥豬生長緩慢，降低飼料報(bào)酬，使養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床癥狀主要表現(xiàn)為：鼻甲骨萎縮、顏面變形、持續(xù)性打噴嚏。多殺性巴氏桿菌毒素（PMT,Pasteurellamultocida to

2、xin）是由片段為3858bp的ToxA基因編碼大小為146kDa的壞死性毒素蛋白，它是PAR主要的保護(hù)性抗原之一。因此本課題通過分子生物學(xué)的方法對PMT進(jìn)行分段研究得到分段重組蛋白，并對其生物學(xué)生性及免疫學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為AR的診斷及防制的進(jìn)一步研究提供技術(shù)支持。
　　 本課題參照GenBank上毒素多殺性巴氏桿菌toxA基因序列AF240778，先設(shè)計(jì)1對引物，從本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的豬源D型產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌中擴(kuò)增出to

3、xA編碼區(qū)3858bp的片段，再根據(jù)toxA基因序列設(shè)計(jì)3對分段引物，即通過PCR方法將產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌的毒素基因進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，得到3個(gè)基因片段分別為1084bp（ZQ）、1092bp（ZH）、906bp（HM），將3個(gè)基因片段轉(zhuǎn)化到克隆載體PMD-18T上進(jìn)行克隆，挑斑后進(jìn)行酶切鑒定為陽性質(zhì)粒后進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確，證明克隆載體構(gòu)建成功，得到3個(gè)正確的克隆質(zhì)粒PMD-ZQ、PMD-ZH、PMD-HM。再利用轉(zhuǎn)化方法將克隆質(zhì)

4、粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體pET32a上，酶切鑒定為陽性質(zhì)粒后進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確，證明表達(dá)載體構(gòu)建成功，得到3個(gè)正確的表達(dá)載體質(zhì)粒PET-ZQ、PET-ZH、PET-HM。
　　 表達(dá)載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）PlysS中通過IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證，得知毒素基因里只有片段ZQ、HM得到表達(dá)，大小分別為75 kDa（ZQ）、50kDa（HM），ZH不表達(dá)。通過Westem blot方法檢測ZQ、HM兩個(gè)

5、重組蛋白，只有HM重組蛋白得到了正確表達(dá)，且有很好的反應(yīng)原性。后期通過Dot-ELISA、小鼠接毒實(shí)驗(yàn)等特異性實(shí)驗(yàn)，對該重組蛋白的生物學(xué)特性及免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，表達(dá)重組蛋白HM具有一定的生物學(xué)活性及反應(yīng)原性和免疫原性；與天然蛋白比較，重組蛋白具有較高的特異性。該研究為多殺性巴氏桿菌毒素的生物學(xué)特性、蛋白功能性結(jié)構(gòu)域及抗原表位的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為豬傳染性萎縮性鼻炎的診斷、檢測和防疫工作提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支持，