黃瓜花葉病毒2b蛋白在RNA沉默通路中的作用方式研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是目前對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)危害最為嚴(yán)重的植物病毒之一。CMV2b蛋白在CMV的致病過程中扮演著致病因子,RNA沉默抑制子和病毒長(zhǎng)距離移動(dòng)決定因子等多個(gè)重要的角色。因此,闡明CMV2b蛋白的致病機(jī)理對(duì)于發(fā)展控制CMV新方法和新策略具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　 FRad352b-CMV重組病毒是用Rad35-CMV株系的2b基因精確替換Fny-CMV株系的2b基因構(gòu)建而成,該

2、重組病毒在多種煙草寄主上均誘導(dǎo)輕花葉癥狀。其突變株FRad352bLeu-CMV病毒,和FRad352b-CMV僅有一個(gè)氨基酸之差,即第55位的Leu是由FRad352b-CMV的Pro突變而來。FRad352bLeu-CMV在本生煙上則引起嚴(yán)重卷曲葉、植株矮化、甚至植株壞死。Northern雜交分析FRad352b-CMV和FRad352bLeu-CMV在本生煙寄主中的子代RNA積累量,接種后第14天,結(jié)果顯示:FRad32bLeu-

3、CMV的子代RNA積累量顯著高于FRad352b-CMV。由此可見,FRad352bLeu-CMV的強(qiáng)致病性與其子代RNA在寄主體內(nèi)的高積累量有關(guān)。通過熒光定量PCR檢測(cè)基因沉默通路中的相關(guān)蛋白因子-AGO蛋白家族和RDR蛋白,結(jié)果顯示:具有高致病性的FRad352bLeu-CMV顯著抑制寄主本生煙AGO家族中AGO1-1、AGO4-1的表達(dá),而弱致病性的FRad352b-CMV侵染的本生煙中,這些沉默因子的表達(dá)量和Mock對(duì)照相比都有

4、所升高。
　　 基于實(shí)驗(yàn)室前期的研究,利用構(gòu)建好的含有FRad352b-CMV和FRad352bLeu-CMV的2b基因的農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)載體35S-2bPro和35S-2bLeu分析2b蛋白的瞬時(shí)表達(dá)對(duì)外源GFP轉(zhuǎn)錄后基因沉默的影響。通過電轉(zhuǎn)化獲得含有不同載體的農(nóng)桿菌,并將表達(dá)不同2b蛋白的農(nóng)桿菌與35S-GFP的農(nóng)桿菌共浸潤(rùn),在轉(zhuǎn)GFP本生煙16c葉組織中分別瞬時(shí)表達(dá)GFP和不同的2b蛋白。共浸潤(rùn)第3天,35S-2bLeu和3

5、5S-Fny2b的浸潤(rùn)區(qū)出現(xiàn)亮綠斑,而35S-2bPro的浸潤(rùn)區(qū)變暗,GFPmRNA的Northern雜交分析確定GFPmRNA在35S-2bLeu和35S-Fny2b的浸潤(rùn)區(qū)大量積累;共浸潤(rùn)后第7天,盡管35S-Fny2b和35S-2bLeu仍表現(xiàn)亮熒光信號(hào),但是,二者浸潤(rùn)區(qū)的GFPmRNA積累水平顯著低于Mock對(duì)照,且與35S-2bPro相當(dāng),這些結(jié)果說明2bLeu雖然在初期對(duì)GFP的局部沉默具有明顯的抑制作用,但隨著時(shí)間的推移,

6、2bLeu并不能抑制浸潤(rùn)區(qū)siRNA的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致局部GFP mRNA的降解。在共浸潤(rùn)第14天,浸潤(rùn)35S-2bPro植株的頂端系統(tǒng)葉表現(xiàn)GFP系統(tǒng)沉默,而浸潤(rùn)35S-2bLeu的植株則依舊顯綠光,說明其頂端的系統(tǒng)葉GFP沒有被誘導(dǎo)沉默。Northern雜交結(jié)果也顯示:在浸潤(rùn)35S-2bPro的植株頂端系統(tǒng)葉中檢測(cè)到少量的GFP mRNA積累,顯著低于在35S-2bLeu或35S-Fny2b浸潤(rùn)的植株頂端系統(tǒng)葉中的積累。通過熒光定量P

7、CR檢測(cè)第3天浸潤(rùn)區(qū)基因沉默通路中的AGO4-1和RDR6,結(jié)果顯示:與Mock相比,出現(xiàn)亮綠斑的35S-2bLeu的浸潤(rùn)區(qū)中AGO4-1和RDR6的積累受到抑制,而GFP發(fā)生降解的35S_2bPro的浸潤(rùn)區(qū)中AGO4-1和RDR6的表達(dá)量反而有一定程度的升高。因此,我們推測(cè)第55位的Leu可以增強(qiáng)2b蛋白對(duì)AGO4-1和RDR6的抑制,從而達(dá)到抑制系統(tǒng)沉默和DNA甲基化的目的。
　　 綜上所述,我們推測(cè)2bLeu介導(dǎo)的高致病性