黃瓜花葉病毒外殼蛋白與番茄光合作用相關(guān)蛋白的互作研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬病毒典型代表種,其外殼蛋白(Coat protein,CP)位于病毒粒子的最外層,與病毒的胞間運(yùn)輸和長(zhǎng)程運(yùn)輸、蚜蟲傳播等密切相關(guān),是CMV重要的癥狀決定因子。光合作用是綠色植物最重要的生理生化活動(dòng)之一,主要由葉綠體蛋白控制和調(diào)節(jié)。植物病毒的侵染通常導(dǎo)致植物葉綠體損傷和葉綠體蛋白的功能失調(diào)。深入理解和研究病毒蛋白-葉綠體蛋白的相互作用,對(duì)揭示植

2、物病毒致病機(jī)理和植物抗病毒機(jī)制具有重要意義。
  本實(shí)驗(yàn)室的前期研究以CMV CP為誘餌從番茄cDNA文庫(kù)中大規(guī)模篩選到9個(gè)與CMV CP互作的光合作用相關(guān)蛋白,本研究選取其中6個(gè)蛋白基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,主要研究成果如下:
  以健康番茄總RNA為模板,通過RT-PCR方法克隆6個(gè)候選基因的完整編碼區(qū)(CDS),構(gòu)建pPR3-N-目的基因的獵物載體,分別與CMV CP誘餌表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化酵母菌株NMY51,涂布于不同的營(yíng)養(yǎng)缺

3、陷型選擇培養(yǎng)基平板,結(jié)果顯示,在酵母菌中,二磷酸核酮糖羧化酶小亞基2a小鏈(rbcs2a)(克隆編號(hào)E104)、二磷酸核酮糖羧化酶小亞基3b小鏈(rbcs3b)(克隆編號(hào)B3)、光系統(tǒng)Ⅱ10KDa多肽PsbR(克隆編號(hào)E57)、光系統(tǒng)Ⅱ中心復(fù)合體蛋白psbY(克隆編號(hào)E161)與CMV CP存在相互作用,而光系統(tǒng)Ⅱ中心復(fù)合體蛋白PsbW(克隆編號(hào)D15)和原葉綠素酸脂酸脂質(zhì)還原酶(克隆編號(hào)D68)與CMV CP不存在相互作用。
 

4、 分別構(gòu)建CMV CP及在酵母菌中與CMV CP互作的4個(gè)光合作用相關(guān)基因的雙分子熒光互補(bǔ)載體YN-CMV CP和YC-B3、YC-E57、YC-E104、YC-E161,將含有YN-CMV CP的農(nóng)桿菌菌液與分別含有YC-B3、YC-E57、YC-E104、YC-E161的農(nóng)桿菌菌液共同注射煙草,激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示所有處理均可發(fā)出黃色熒光,說(shuō)明在煙草葉片中CMV CP與上述四個(gè)蛋白互作,與酵母雙雜交的結(jié)果一致。
  初

5、步確定CMV CP與互作蛋白的互作功能域。將CMV CP基因序列分成三段:1-327bp(CMV CP-1)、163-489bp(CMV CP-2)、328-654bp(CMVCP-3)分別構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體,即YN-CMV CP-1、YN-CMV CP-2、YN-CMV CP-3,分別與YC-B3、YC-E57、YC-E104、YC-E161轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌注射煙草,,激光共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果顯示:YN-CMV CP-1、2、3+ Y

6、C-B3,YN-CMV CP-1、3+YC-E57, YN-CMV CP-1、2、3+YC-E104, YN-CMV CP-1、2+ YC-E161有黃色熒光;YN-CMV CP-2+ YC-E57,YN-CMV CP-3+ YC-E161無(wú)黃色熒光。表明CMV CP具有多個(gè)與寄主蛋白的互作位點(diǎn),且CMV CP與不同的寄主蛋白互作位點(diǎn)不同。
  為進(jìn)一步分析CMV CP與B3、E57、E104、E161的互作位點(diǎn),通過同源建模軟件

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