懷山藥體細(xì)胞胚胎發(fā)生與DoSERK2基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、懷山藥(Dioscorea opposita Thunb.)是薯蕷科薯蕷屬多年生革質(zhì)藤本植物，其地下塊莖部分藥食兼優(yōu)，但由于長(zhǎng)時(shí)間的無(wú)性繁殖，造成品質(zhì)退化和產(chǎn)量降低。本研究在前期已克隆懷山藥DoSERK2基因并構(gòu)建其過(guò)表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展懷山藥體細(xì)胞胚胎發(fā)生與DoSERK2基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究，對(duì)于懷山藥的快速繁殖、基因功能的鑒定以及基因工程育種具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:
　　1.懷山藥的體細(xì)胞胚胎發(fā)生
　　(1

2、)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。毒莠定(Picloram, PIC)是影響懷山藥體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，在含不同濃度毒莠定的培養(yǎng)基上帶腋芽莖段均可誘導(dǎo)形成體胚，以培養(yǎng)基MS+PIC5 mg·L-1+ CuSO42μmol·L-1的誘導(dǎo)效果最佳，8周時(shí)體胚誘導(dǎo)率和平均體胚數(shù)分別為91.67％和6個(gè)。將帶腋芽莖段、帶節(jié)點(diǎn)莖段、葉片三種外植體在最佳體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，帶腋芽莖段的誘導(dǎo)效果最為理想。
　　(2)體細(xì)胞胚的增殖與分化。體胚最佳增殖培養(yǎng)基

3、為MS+6-BA0.5 mg·L-1+ Pic1mg·L-1+ CH0.6 g·L-1+ Pro1 g·L-1，增殖系數(shù)達(dá)到3.25。光照下體胚表面生成黃色或白色致密愈傷組織，生長(zhǎng)一段時(shí)間后，變成綠色，將其轉(zhuǎn)接到MS+6-BA0.4 mg·L-1培養(yǎng)基上培養(yǎng)，6-7周后再生出植株。
　　(3)體細(xì)胞胚的鑒定。以醋酸洋紅和伊文思藍(lán)進(jìn)行雙染色，證明懷山藥莖段腋芽處長(zhǎng)出的小球是由胚性組織聚合成的胚狀體，隨后發(fā)育成球形胚、盾形胚和畸形胚，

4、畸形胚不能形成再生植株。對(duì)球形胚增殖過(guò)程中產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行雙染色，發(fā)現(xiàn)只有致密黃色或白色組織是胚性愈傷組織。
　　2.懷山藥DoSERK2基因的遺傳轉(zhuǎn)化
　　(1)構(gòu)建了懷山藥DoSERK2基因的沉默載體pART27-SERK。先將干擾片段重組到中間載體pHANNIBAL上，將帶有35S啟動(dòng)子和NOS終止子的干擾片段切下插入到載體pART27上，完成沉默載體的構(gòu)建。
　　(2)懷山藥不同外植體的抗生素敏感性不同，潮霉

5、素(Hyg)和卡那霉素(Kan)對(duì)懷山藥類原球莖的選擇壓分別為15 mg·L-1和160 mg·L-1;二者對(duì)微型塊莖的選擇壓分別為15 mg·L-1和120 mg· L-1;二者對(duì)再生苗生根的選擇壓分別為20 mg·L-1和160 mg·L-1;抑菌劑特美汀(Tim)的濃度確定為500 mg· L-1。
　　(3)初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的懷山藥微型塊莖遺傳轉(zhuǎn)化體系。含過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301-SERK農(nóng)桿菌OD600為0.

6、5，侵染30 min后，將微型塊莖切片轉(zhuǎn)接到含AS100μmol·L-1的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，然后在含Hyg15 mg·L-1的再生苗培養(yǎng)基和含Hyg20 mg· L-1生根培養(yǎng)基上篩選，獲得生根良好的抗性再生植株，經(jīng)GUS和PCR檢測(cè)獲得DoSERK2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。以上述同樣方法，將沉默載體pART27-SERK轉(zhuǎn)化微型塊莖，微型塊莖再生篩選壓為Kan120 mg·L-1和再生苗生根篩選壓為Kan160 mg·L-1，經(jīng)PCR檢測(cè)