農(nóng)用抗生素尼莫克汀高產(chǎn)菌株的推理選育.pdf

1、尼莫克?。∟emadectin）是一種十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，由藍(lán)灰鏈霉菌Streptomyces cyaneogriseus sp. Noncyanogenus經(jīng)發(fā)酵過(guò)程生產(chǎn)。作為米爾貝霉素族的一員，尼莫克汀主要用于合成活性更強(qiáng)的農(nóng)藥獸藥莫西克汀（Moxidectin）。本論文運(yùn)用推理選育的方法篩選尼莫克汀高產(chǎn)菌株，然后運(yùn)用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了適合于高產(chǎn)菌株的發(fā)酵參數(shù)，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
　　 首

2、先對(duì)尼莫克汀產(chǎn)生菌原始菌株進(jìn)行兩次純化，使遺傳性狀穩(wěn)定，以純化后的菌株N-03-16為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變進(jìn)行推理選育。根據(jù)尼莫克汀的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理，選擇乙酸鈉、纈氨酸、纈氨酸氧肟酸和2-脫氧葡萄糖作為篩選壓力，結(jié)合分離純化，得到菌株N-09-20，產(chǎn)量達(dá)到77 mg/L，比原始菌株提高了4倍。同時(shí)對(duì)比了內(nèi)源性前體誘導(dǎo)和結(jié)構(gòu)類(lèi)似物耐受的篩選效果。之后經(jīng)過(guò)鏈霉素抗性篩選得到菌株N-11-37，產(chǎn)量達(dá)到99 mg/L，較出發(fā)菌株

3、N-09-20提高了28.6％，由此建立了鏈霉素篩選模型。以N-11-37為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)4次自身代謝產(chǎn)物耐受，篩選得到高產(chǎn)菌株N-16-19，產(chǎn)量達(dá)到172 mg/L，比原始菌株提高了10倍，成功的應(yīng)用了自身代謝調(diào)節(jié)突變篩選模型。對(duì)菌株N-16-19進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)5次傳代后，結(jié)果表明該菌株有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 對(duì)高產(chǎn)菌株N-16-19的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了一系列發(fā)酵工藝。經(jīng)過(guò)配方優(yōu)化之后，確定了新的斜面

4、培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成。在新的斜面培養(yǎng)基上，孢子形態(tài)為青灰色，圓形，菌絲產(chǎn)黃綠色色素。優(yōu)化后的發(fā)酵配方為（g/L）：葡萄糖20、乳糖30、麥芽糊精40、玉米淀粉20、蛋白胨2、黃豆餅粉4、棉籽餅粉8，CaCO3 3，Ph 7.0，使用自來(lái)水配制。在新的發(fā)酵配方下，尼莫克汀的產(chǎn)量達(dá)到236 mg/L，比原始配方提高了67％。同時(shí)，確定了菌齡、接孢量、種齡、移種量和發(fā)酵溫度等發(fā)酵過(guò)程參數(shù)，同時(shí)對(duì)溶氧要求進(jìn)行考察，得知該菌株對(duì)溶氧水平要求很高

5、。通過(guò)短鏈脂肪酸前體和氨基酸前體的添加，考察了尼莫克汀產(chǎn)生菌對(duì)前體的利用情況，并且確定在72 h、120 h、168 h分3次添加總量為0.2％的乙酸鈉，以及在48 h、96 h、144 h分3次添加總量為0.3％的纈氨酸時(shí)，尼莫克汀的產(chǎn)量有大幅度增加。
　　 研究了在新的發(fā)酵工藝下尼莫克汀產(chǎn)生菌發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)素變化，以及生物量、Ph、總糖、還原糖和氨基氮的代謝變化。確定了發(fā)酵過(guò)程中，72 h開(kāi)始產(chǎn)素，在96 h發(fā)酵液由棕黃色漸