布魯氏菌蛋白質(zhì)抗原靶向化樹突狀細(xì)胞疫苗的研制.pdf

1、布魯氏菌是典型的胞內(nèi)感染菌，自然感染狀態(tài)下，由于巨噬細(xì)胞表達(dá)高豐度的布魯氏菌模式識別受體，所以成為布魯氏菌感染的主要靶細(xì)胞。研究證明，布魯氏菌侵入巨噬細(xì)胞后可通過抑制TNF-α的分泌而抑制巨噬細(xì)胞凋亡，從而可在細(xì)胞內(nèi)生存并大量繁殖，削弱巨噬細(xì)胞吞噬功能，使巨噬細(xì)胞的殺傷作用與抗原提呈功能部分喪失，最終逃避宿主的免疫監(jiān)視；另一方面，巨噬細(xì)胞激活初始T細(xì)胞的能力較弱，也不表達(dá)有抗原提呈功能的CD1分子，故不能有效提呈脂類抗原給NKT細(xì)胞；這

2、可能是導(dǎo)致布魯氏菌持續(xù)感染形成的原因。
　　 樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs)是目前所知功能最強(qiáng)大、且能激活初始性T（na?ve T cell）細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，不僅可以通過MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類途徑提呈抗原，而且還擁有提呈脂類抗原的CD1分子。但由于DCs只表達(dá)低豐度的布魯氏菌模式識別受體，所以捕獲布魯氏菌的能力較弱。
　　 為比較兩

3、種細(xì)胞負(fù)載布魯氏菌后形態(tài)學(xué)變化，對負(fù)載布魯氏菌后的巨噬細(xì)胞與DCs進(jìn)行姬姆薩染色。結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞負(fù)載布魯氏菌4h，吞噬布魯氏菌的數(shù)量明顯增多；在6 h，巨噬細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)脫落現(xiàn)象；至8h胞質(zhì)脫落現(xiàn)象增多，個(gè)別細(xì)胞的細(xì)胞膜幾乎完全消失；至12h，大部分巨噬細(xì)胞出現(xiàn)了胞質(zhì)脫落、細(xì)胞膜消失與核固縮現(xiàn)象，并有膜包小泡被釋放至胞外。而DCs負(fù)載布魯氏菌后4 h，出現(xiàn)細(xì)菌與DCs黏附并有少量細(xì)菌被吞噬的現(xiàn)象；6 h～8 h DCs吞噬布魯氏菌的數(shù)

4、量明顯增多；10 h～12 h黏附現(xiàn)象消失，絕大多數(shù)DCs吞噬了布魯氏菌；以上結(jié)果證明，巨噬細(xì)胞負(fù)載布魯氏菌后形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞，而DCs捕獲布魯氏菌后結(jié)構(gòu)始終保持完整。因此為了使DCs發(fā)揮其強(qiáng)大抗原提呈作用，避免巨噬細(xì)胞在布魯氏菌感染后造成的免疫缺陷，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了靶向DCs的新型布魯氏菌疫苗。
　　 布魯氏菌的脂多糖和外膜蛋白質(zhì)(outer membrane proteins，OMPs)是構(gòu)成細(xì)菌毒力及免疫原性的重要因素，但脂多

5、糖免疫原性較弱，因此在本試驗(yàn)中選擇布魯氏菌OMPs作為目的抗原。本試驗(yàn)采用去污劑連續(xù)抽提與電洗脫的方法，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表明分子量為37.5 kD與47.2 kD的兩種布魯氏菌OMPs已被成功提取純化。隨后用兩種蛋白質(zhì)與弗氏佐劑混合乳化，皮下注射BALB/c小鼠，同時(shí)用商品布魯氏菌凍干疫苗作對照，在第4次免疫后收集外周血制備血清。為檢測布魯氏菌OMPs的免疫原性，以純化的布魯氏菌蛋白質(zhì)為抗原，分別與疫苗組和蛋白質(zhì)組小鼠血清作雙向

6、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在2倍稀釋血清孔周圍均出現(xiàn)沉淀線，說明兩種蛋白質(zhì)混合后具有很好的免疫原性。用間接ELISA檢測各試驗(yàn)組小鼠血清中IgG的含量（P/N＞1.5），檢測結(jié)果分別為，疫苗組：1:160；蛋白組：1:320；可見2種蛋白免疫效果明顯好于疫苗組，因此這2種蛋白質(zhì)被選作本試驗(yàn)的目的抗原。
　　 甘露糖受體（mannose receptor MR）是DCs和巨噬細(xì)胞所特有的膜受體，未成熟的DCs表達(dá)高水平的MR，能有效

7、地捕獲含有甘露糖殘基的生物大分子或微生物。但天然布魯氏菌蛋白含甘露糖殘基甚微，因此為增強(qiáng)MR介導(dǎo)的抗原攝取與提呈功能，利用糖基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫O-GlycBase與糖基化位點(diǎn)預(yù)測工具軟件，確定了兩種蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)為賴氨酸分子上的ε-氨基，采用α-D-甘露吡喃異硫氰酸苯酯對兩種目的蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行甘露糖修飾，間苯二酚-硫酸法鑒定結(jié)果表明，兩種蛋白質(zhì)抗原已被成功糖基化修飾。隨后，把糖基化蛋白質(zhì)與弗氏佐劑混合乳化，同時(shí)用弗氏佐劑混合乳化的純化蛋

8、白質(zhì)、弗氏佐劑混合乳化的PBS、商品布魯氏菌凍干疫苗作對照，BALB/c小鼠皮下注射，第4次免疫后眼球采血制備血清。試管凝集試驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化后，與純化蛋白(抗體效價(jià)1:240)和疫苗(抗體效價(jià)1:120)免疫效果相比，體液免疫水平明顯降低(抗體效價(jià)1:10)。ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，純化蛋白質(zhì)組、糖基化蛋白質(zhì)組與疫苗組IFN-γ血清水平均顯著高于PBS對照組(P＜0.01)，并且糖基化蛋白質(zhì)組IFN-γ血清水平明顯高于純化蛋白質(zhì)

9、組(P＜0.01）與疫苗組(P＜0.05）；而IL-4血清水平除純化蛋白質(zhì)組顯著高于PBS對照組外(P＜0.05)，其余兩組與PBS對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)；說明三種抗原注射后都有效引發(fā)了機(jī)體的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答，且蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后免疫效果顯著優(yōu)于未糖基化蛋白質(zhì)與布魯氏菌凍干疫苗。據(jù)此推測，蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后，提高了DCs吞噬與提呈抗原的作用，從而引起了機(jī)體更高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　 為了避免弗氏佐劑的副

10、作用，提高糖基化蛋白質(zhì)的免疫效果，使糖基化蛋白更好地發(fā)揮靶向性作用，本研究選擇油包水佐劑50V作為佐劑，與糖基化蛋白混合乳化后接種小鼠，分別在1免后4 d、2免后3 d、5 d、7 d眼球采血制備血清，用ELISA檢測血清IFN-γ的含量。布魯氏菌凍干疫苗免疫后，在1免4d至2免3d，IFN-γ水平呈上升趨勢，并且顯著高于糖基化蛋白質(zhì)組與純化蛋白質(zhì)組(P＜0.05)，但2免5 d后，IFN-γ水平急劇下降，至2免7 d，IFN-γ水平顯

11、著低于糖基化蛋白質(zhì)組與純化蛋白質(zhì)組(P＜0.05)，表明布魯氏菌凍干疫苗接種后雖然在短期內(nèi)激發(fā)了機(jī)體高水平的IFN-γ免疫應(yīng)答，但維持時(shí)間較短，且不能產(chǎn)生良好的免疫記憶。而糖基化蛋白質(zhì)免疫后，IFN-γ水平持續(xù)上升，并在2免后5 d至7 d，顯著高于純化蛋白質(zhì)組與疫苗組(P＜0.05)，說明糖基化蛋白質(zhì)免疫后隨著佐劑不斷被吸收，IFN-γ水平不斷上升，激發(fā)了機(jī)體有效的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答，且免疫水平顯著高于未糖基化蛋白質(zhì)與布魯氏菌凍干疫苗