SMYD3在牛卵母細胞體外成熟過程中表達及功能的研究.pdf

1、SMYD3是組蛋白3第4位賴氨酸二甲基化、三甲基化特異性轉移酶，具有執(zhí)行甲基轉移酶活性的SET結構域和參與蛋白互作、識別特異DNA序列的MYND鋅指基序。SMYD3通過結合靶基因啟動子區(qū)序列催化形成H3K4me3活性轉錄標志，而調(diào)節(jié)其下游一系列基因的激活和表達，其中包括端粒酶逆轉錄酶等。牛卵母細胞體外成熟過程中一直維持H3K4me3修飾狀態(tài)。目前只發(fā)現(xiàn)兩種特異性催化H3K4me3的酶SMYD3和Meisetz。Meisetz只在兩性生殖

2、細胞減數(shù)分裂前復制期到粗線期過程中表達，粗線期后不再表達，說明粗線期后有其他特異性甲基轉移酶維持H3K4me3修飾狀態(tài)，其中，SMYD3可能在這一過程中起重要作用。SMYD3的作用機理在癌細胞中已被廣泛研究，但在卵母細胞成熟、受精及早期胚胎發(fā)育過程中的研究還很有限。本研究首先對牛卵母細胞體外成熟過程中SMYD3基因的mRNA和蛋白質水平的動態(tài)變化進行了研究；同時針對SMYD3 mRNA上游、中游、下游設計抑制位點專一性的短干擾RNA片段

3、(siRNA)，對牛GV期去顆粒細胞卵母細胞進行聯(lián)合注射，研究在成熟過程中干擾SMYD3 mRNA表達對牛卵母細胞成熟、受精及早期胚胎發(fā)育的影響，并對體外受精7h的合子進行注射，研究受精后干擾SMYD3 mRNA表達對早期胚胎發(fā)育的影響。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴在建立的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，0、8、12、18、24 h分別有82.9%、80.3%、75.1%、63.3%、70.9%比例的卵母細胞處于GV期、PMI期、MI期、AI-

4、TI期、MII期。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，可用0、8、12、18、24h體外培養(yǎng)時間作為收集處于減數(shù)分裂GV期、PMI期、MI期、AI-TI期、MII期的卵母細胞的依據(jù)。用熒光實時定量PCR檢測SMYD3 mRNA在牛卵母細胞體外成熟過程中表達的結果顯示：牛SMYD3 mRNA在牛卵母細胞減數(shù)分裂各時期持續(xù)表達，相對于GV期，表達水平在MI期、AI-TI期明顯升高(P<0.05)，AI-TI期后到MII期逐漸下降，但差異不顯著(P>0.05)。免

5、疫化學方法檢測SMYD3蛋白表達結果表明：SMYD3在AI-TI期大量翻譯蛋白并到MII期蛋白量持續(xù)上升，且始終圍繞在染色體的周圍。說明SMYD3 mRNA的積累主要在AI-TI期之前完成，蛋白的大量合成和發(fā)揮作用始于AI-TI期，可能對維持后期H3K4me3基因轉錄激活信號的形成起關鍵作用。在SMYD3 mRNA表達的研究中，檢測到一個未見報道的SMYD3轉錄本。測序結果與基因組DNA全序列比對，發(fā)現(xiàn)該轉錄本位于此基因7號內(nèi)含子DNA

6、序列9803-9913bp，符合真核生物GT-AG傳統(tǒng)剪接方式，也可作為外顯子進行轉錄。進一步研究顯示來自不同個體的卵母細胞或來自同一個體的不同組織肝臟、肺臟、睪丸、脾臟及心臟都存在相同的轉錄本，表明SMYD3此種可變剪接無個體和組織特異性。
　　 ⑵針對牛SMYD3 mRNA的第281-299、567-585、1030-1048bp區(qū)域分別設計siRNA干涉序列，三片段聯(lián)合對GV期去顆粒細胞的裸卵進行顯微注射，培養(yǎng)24h后SM

7、YD3 mRNA的表達量與對照組相比下降到18%，干擾效率顯著。GV期去顆粒細胞的裸卵注射SMYD3-siRNA研究結果表明：SMYD3-siRNA注射組與陰性對照Nos-siRNA注射組(無義干擾片段)成熟率無顯著差異(67.14% vs66.06%，P>0.05)，說明干擾SMYD3 mRNA的表達不影響卵母細胞的成熟。非注射對照組卵丘卵母細胞復合體(COCs)和GV期去顆粒細胞裸卵(DOs)的成熟率無顯著差異(75.54% vs7

8、6.19%，P>0.05)，說明GV期機械去除顆粒細胞不影響卵母細胞成熟；但注射組與非注射組體外成熟率差異極顯著(67.14%、66.06% vs75.54%、76.19%，P<0.01)，可能是由于顯微注射操作過程中的機械損傷造成。GV期進行胞質注射SMYD3-siRNA實驗組、注射Nos-siRNA陰性對照組及非注射組對照組COCs、DOs各組卵母細胞體外成熟培養(yǎng)22h后進行體外受精。結果顯示：SMYD3-siRNA注射組、DOs組

9、、Nos-siRNA注射組之間卵裂率均無顯著差異(44.07% vs42.8% vs42.95%，P>0.05)；但SMYD3-siRNA注射組的8細胞率、囊胚率顯著低于DOs組、Nos-siRNA注射組(3.29% vs17.51%、12.82%；0%vs10.89%、8.33%，P<0.01)，表明GV期去顆粒細胞裸卵注射SMYD3-siRNA不影響卵母細胞的受精和卵裂，但顯著降低8細胞率和囊胚率，可能是因為SMYD3激活了某些在胚

10、胎由2細胞到囊胚發(fā)育過程中起重要作用的基因。而DOs與Nos-siRNA注射組的8細胞率、囊胚率均無顯著差異(17.51% vs12.82%，10.89% vs8.33%，P>0，05)，說明顯微注射的機械損傷對實驗結果沒有影響。另外，COCs與DOs、Nos-siRNA注射組、SMYD3-siRNA注射組的卵裂率、8細胞率、囊胚率差異均極顯著(66.95% vs42.8%、42.95%、44.07%；40.34% vs17.51%、1

11、2.82%、3.29%；30.47% vs10.89%、8.33%、0%，P<0.01)，說明顆粒細胞對卵母細胞的體外受精過程有重要作用。
　　 ⑶對經(jīng)體外成熟并受精7h后的合子進行SMYD3-siRNA注射實驗，結果表明：SMYD3-siRNA注射組與對照組非注射受精卵、Nos-siRNA注射組的卵裂率、8細胞率、囊胚率均無顯著差異(55.88% vs56.88% vs58.43%；32.35% vs34.94% vs31.9

12、0%；23.83% vs29.0% vs24.01%， P>0.05)。說明SMYD3影響胚胎由2細胞到囊胚發(fā)育的機能不是在受精后建立的。綜上所述，GV期去顆粒細胞裸卵干擾SMYD3 mRNA表達后不影響牛卵母細胞體外成熟、受精及卵裂，但嚴重降低2細胞胚胎到囊胚的發(fā)育，而受精后7h再干擾合子的SMYD3 mRNA表達對卵裂、2細胞、8細胞及囊胚的發(fā)育都沒有影響。由此說明，SMYD3通過激活某些在胚胎從2細胞到囊胚正常發(fā)育中起重要作用的基