家蠶細胞色素CYP337A1的克隆與原核表達.pdf

1、細胞色P450單加氧酶系是一類廣泛分布于生物有機體中的重要酶系，P450酶曾被稱為多功能氧化酶(MFO)、單加氧酶(monooxygenase)、芳香烴羥化酶和藥物代謝酶等多種名稱。它能夠代謝多種內源性物質和外源性物質，細胞色素P450酶系不僅涉及一系列內源性物質如保幼激素及其類似物、蛻皮甾醇和生物信息素的代謝，也涉及對外源性物質如殺蟲劑、植物次生物質和環(huán)境污染物等多種化合物的代謝，因其生物學的重要性，一直是生物學領域研究的一個重要對象

2、。 為了在分子水平上研究家蠶胞色素P450基因的特性，更好地探討其與抗性相關機制，本研究就家蠶細胞色素P450基因的克隆及異源表達開展了研究，主要研究結果如下： 1.選定克隆序列從NCBI下載果蠅(Drosophila melanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)等多種昆蟲P450s蛋白質序列，和西南人學家蠶基因組數(shù)據(jù)中所預測的家蠶基因蛋白質序列進行BLAST P比對，其E-valve≤l

3、e-7，得到66條含有血紅素結合標志性位點(P450 Signature)F××G×××C×G的P450基因序列，選擇了主要與抗性相關的CYP3集團(clan)中具有完全編碼框的基因(并含有P450基因特征結構域)的1條序列，據(jù)此設計引物。經過PCR擴增得到一條長度約為1，470 bp的目的條帶。 2.采甩T-A克隆法對該基岡序列進行了克隆測序結果表明，該基因ORF為1，470 bp，編碼489個氨基酸，Expasy網站預測蛋白

4、質分子質量為56.60 KDa，符合一般P450s的分子量為46～60 KDa的規(guī)律，等電點為8.64。用Sim4程序，將該基因核酸序列與家蠶基因組序列相比較發(fā)現(xiàn)只含有1個內含子，大小為1，903 bp，外顯子和內含子邊界處符合GT-AG規(guī)則。在推定的氨基酸序列中包含所有昆蟲P450基因的5個特征序列，即：P450基因標志性的F××G×××C×G(428-437)血紅素結合位點的共有序列；位于螺旋C中與血紅素結合有關的保守序列W×××R

5、(116-120)；位于螺旋Ⅰ中P450氧結合部位的AG×E/DT(295-299)保守序列；位于螺旋K中參與穩(wěn)定核心結構的E××R(353-356)完全保守序列；以及特征序列‘PERF’的P××F×PE/DRT(404-412)。經蛋白質結構分析發(fā)現(xiàn)其N端包含有一條高度疏水性的信號肽序列，22個氨基酸中含有15個疏水氨基酸。 3.和其它已測序的家蠶P450基因的同源性分析從NCBI下載已測序登陸的26個家蠶細胞色素P450基因的氨基酸

6、序列，根據(jù)MEGA 3.1程序，運用近鄰法(NJ，neighbor joining)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，得出該基岡和以代謝異生物質為主的CYP6和CYP9家族基因的同源關系較近，和以代謝內源物質為主的CYP4家族基岡的同源關系較遠，而和以合成與代謝昆蟲體內蛻皮激素、保幼激素等為主的其他家族基因的同源關系則更遠。 4.和其它家族成員的同源性分析在NCBI進行BLASTP在線同源性比對，發(fā)現(xiàn)美國棉鈴蟲CYP321A1和邪惡按蚊CYP6P

7、9的同源性相對較高，分別為34％、32％，均低于40％。根據(jù)規(guī)則，被國際細胞色素P450委員會命名為新家族的第一個基岡CYP337A1(GenBank登陸號：EF415297)。下載同源性較高，且具有代表性的其它家族成員的序列，利用ClustalX 1.83進行氨基酸相似性的聚類分析。CYP337A1具有CYP6等家族基因擁有的血紅素保守結合區(qū)PF××G×R×C×G，但在CYP6家族基因高度保守的ETLR序列及PERF序列中均發(fā)生了一定

8、變異，它和已經與CYP6家族基因趨異分離的CYP321A1同源性相對最高。 5.原核表達 以pET50(b)為表達載體，將CYP337A1基因的編碼區(qū)亞克隆至pET50(b)構建重組表達質粒，轉化至BL21細胞，挑取單克隆用TB培養(yǎng)基在37℃進行培養(yǎng)并用1 mmol/L IPTG誘導表達該基因的蛋白質。同時以轉化有pET50(b)空載體的同時誘導作為對照。經SDS-PAGE電泳在120 KDa左右得到特異目的蛋白帶，pE

9、T50(b)表達載體中Nus．Tag標簽是64.3 KDa，而表達產物的蛋白分子量在56.60 KDa左右，所以，與His的融合蛋白的分子量是120 KDa。實驗結果與預期一致，說明該基因編碼的蛋白得到了表達。 6.表達條件優(yōu)化進一步利用不同條件對含重組質粒的菌液進行誘導，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在溫度為32℃～37℃，IPTG濃度為0.6 mmol/L時，誘導2 h左右，蛋白表達量最大。該實驗為利用該基因的蛋白產物進行功能分析創(chuàng)造了條件。