Bcl-2多位點(diǎn)磷酸化誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋亡.pdf

1、心力衰竭簡(jiǎn)稱心衰，是多種心血管疾病的終末期狀態(tài)。心衰患者心臟功能嚴(yán)重降低，勞動(dòng)能力喪失，死亡率居高不下，使之成為威脅社會(huì)公眾健康的嚴(yán)峻問題。高血壓性心臟病是導(dǎo)致心力衰竭的主要致病因素。根據(jù)2009年12月發(fā)布的《中國(guó)高血壓防治指南》數(shù)據(jù)顯示：我國(guó)居民高血壓患病率持續(xù)增高，現(xiàn)估計(jì)高血壓患者達(dá)2億人。高壓力負(fù)荷狀態(tài)早期，心臟結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)代償性改變，主要表現(xiàn)為心肌肥厚重塑，這在一定階段尚能夠滿足機(jī)體需要。持續(xù)高血壓時(shí)，這種代償逐漸不能滿足機(jī)

2、體需要，從而進(jìn)入失代償階段，出現(xiàn)心功能衰竭。高血壓患者從心肌肥厚到出現(xiàn)心功能衰竭的進(jìn)程中，心臟的結(jié)構(gòu)與功能究竟發(fā)生了怎樣的變化，有哪些因素參與，其可能的機(jī)制等問題尚不甚明了。
　　為探討上述問題，我們采取下列實(shí)驗(yàn)展開研究：(1)采用手術(shù)縮窄大鼠腹主動(dòng)脈(transverseaorticconstriction，TAC)的方法來建立高血壓心肌肥厚動(dòng)物模型，并采用第10胸椎水平脊髓離斷的方法來研究血壓變化規(guī)律及可能的機(jī)制；(2)檢測(cè)肥

3、大心臟心肌組織結(jié)構(gòu)的改變，并酶解分離肥厚心臟，獲取游離心肌細(xì)胞以檢測(cè)單心肌細(xì)胞功能變化；(3)采用TUNEL法、蛋白印跡法、免疫組化染色合并激光共聚焦成像等方法探討心肌細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.腹主動(dòng)脈縮窄部位以下肢體，可能通過某種神經(jīng)反饋機(jī)制參與血壓升高調(diào)節(jié)。于第10胸椎處離斷脊髓，切斷截面以下軀體神經(jīng)支配。脊髓離斷(spinalcordtransection,SCT)與假手術(shù)對(duì)照(control,CON)

4、大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄(transverseabdominalaorticconstriction,TAC)，手術(shù)后即刻兩組大鼠下肢股動(dòng)脈血壓均顯著降低；CON組大鼠TAC術(shù)后1w股動(dòng)脈血壓和頸動(dòng)脈血壓均升高，而SCT組大鼠股動(dòng)脈和頸動(dòng)脈血壓升高并不明顯。提示：腹主動(dòng)脈縮窄大鼠，縮窄部位以下肢體能夠通過某種神經(jīng)反饋機(jī)制參與血壓升高的調(diào)節(jié)。
　　2.TAC高血壓大鼠心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)。由于TAC大鼠手術(shù)后體重增長(zhǎng)明顯慢于同步對(duì)照假手術(shù)組

5、，用左心室質(zhì)量與體重比來衡量心肌肥厚存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差，而膠原酶分離心肌細(xì)胞后，直接測(cè)量單個(gè)心肌細(xì)胞長(zhǎng)度與寬度能較好反映心肌細(xì)胞的肥大程度。心肌細(xì)胞肥大初期以寬度增加為主，后期以長(zhǎng)度增長(zhǎng)為主。
　　3.肥大心肌細(xì)胞肌節(jié)長(zhǎng)度不變，但肌節(jié)數(shù)目增多。采用免疫組化法染色心肌纖維Z線富集蛋白desmin，測(cè)量肌節(jié)長(zhǎng)度，計(jì)數(shù)肌節(jié)數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肥大心肌細(xì)胞表現(xiàn)為單細(xì)胞內(nèi)肌節(jié)數(shù)目增多而長(zhǎng)度不變。
　　4.單心肌細(xì)胞收縮功能先代償性增強(qiáng)后逐

6、漸降低，考慮與細(xì)胞內(nèi)在因素改變有關(guān)。采用Tyrode液灌流下正電壓連續(xù)單刺激分析測(cè)量單心肌細(xì)胞縮短幅值變化的百分比與舒張時(shí)程RT75。結(jié)果表明：與同期CON相比，1wTAC組心肌細(xì)胞縮短幅值增大，8w時(shí)無明顯差別，16w后則低于對(duì)照；心肌細(xì)胞舒張時(shí)程TAC組從第8周開始，逐步延長(zhǎng)且高于對(duì)照。在排除了膠原限制、可能缺氧等因素后，考慮肥大心肌細(xì)胞收縮功能降低與細(xì)胞內(nèi)在因素改變有關(guān)。
　　5.肥大心肌細(xì)胞凋亡率升高，PKCδ參與介導(dǎo)肥大

7、心肌細(xì)胞凋亡。TUNEL法檢測(cè)心肌組織石蠟切片凋亡率，與CON相比TAC肥大心肌內(nèi)心肌細(xì)胞凋亡率升高；工作心臟分別灌流AngⅡ與PKCδ特異性抑制劑Rottlerin，AngⅡ灌流能夠顯著升高心肌細(xì)胞凋亡率，而加入PKCδ特異性抑制劑Rottlerin能夠抑制AngⅡ引起的凋亡率升高，說明PKCδ參與介導(dǎo)AngII誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋亡。
　　6.活化PKCδ向線粒體轉(zhuǎn)位，Bcl-2Ser87位磷酸化增加可能為心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制。肥厚

8、心肌與正常心肌相比：PKCδ表達(dá)量增多，p-Akt降低，Bcl-2表達(dá)量略有降低；AngII灌流能夠促進(jìn)PKCδ活化后向線粒體轉(zhuǎn)位，使Ser87位磷酸化Bcl-2和Ser70位磷酸化的Bcl-2比例升高，線粒體細(xì)胞色素C釋放增多，caspase-3活性增強(qiáng)，心肌細(xì)胞凋亡率升高；而同時(shí)使用PKCδ拮抗劑Rottlerin后，可以抑制AngII誘發(fā)的這些效應(yīng)。說明PKCδ可能通過磷酸化Bcl-2第87位絲氨酸，拮抗Bcl-2的抗凋亡保護(hù)作用