櫛孔扇貝(Chlamys farreri)能量代謝與抗氧化脅迫能力評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的構(gòu)建.pdf

1、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）是我國本土重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，自然分布于山東半島以及遼東半島沿海地區(qū)。近年來，養(yǎng)殖區(qū)櫛孔扇貝在夏季頻發(fā)出現(xiàn)大規(guī)模死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外學(xué)者從環(huán)境生態(tài)學(xué)、病原學(xué)、貝類免疫學(xué)以及種質(zhì)遺傳學(xué)等多個(gè)角度對(duì)其進(jìn)行了研究，但迄今尚未找到十分有效的解決辦法。本研究通過分析櫛孔扇貝正常生長(zhǎng)、衰老過程中代謝及抗逆相關(guān)生理指標(biāo)的變化，結(jié)合相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)分析，從分子及生化水平較為系統(tǒng)的研究了生殖及高溫脅

2、迫下扇貝各組織能量代謝及抗氧化能力的變化，為指導(dǎo)扇貝抗逆品系的選育，闡明扇貝群體夏季大規(guī)模死亡的原因提供參考。
　　1、櫛孔扇貝抗逆相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的構(gòu)建
　　我們分析了穩(wěn)態(tài)維持相關(guān)的端粒調(diào)控、全基因組甲基化水平、能量代謝以及抗氧化能力在1-4齡櫛孔扇貝中的變化情況。端粒研究結(jié)果表明，端粒長(zhǎng)度、端粒酶活性及相關(guān)基因的表達(dá)之間顯著相關(guān)，但僅在4齡櫛孔扇貝肝胰腺中表現(xiàn)出顯著的端粒長(zhǎng)度縮短以及TERT表達(dá)下降（P<0.05）。全基

3、因組甲基化水平分析結(jié)果顯示，不同年齡組間外套膜、腎臟及肝胰腺的DNA甲基化水平差異顯著（P<0.05），隨年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；外套膜及肝胰腺的DNMT1表達(dá)在1、4齡實(shí)驗(yàn)組間有顯著差異（P<0.05）。此外，研究結(jié)果表明，能量代謝及抗氧化相關(guān)指標(biāo)（SOD、CAT、GOT、GPT、LDH、ROS、MDA、ATP）在櫛孔扇貝大部分組織中與年齡顯著相關(guān)（P<0.05），呈現(xiàn)出一致的增齡性變化規(guī)律。因此，本研究選擇組織中廣泛存在且年齡組間變化顯

4、著的能量代謝及抗氧化相關(guān)指標(biāo)，通過主成分分析，建立組織特異性綜合指數(shù)表達(dá)式，例如在腎臟中，綜合指數(shù)N腎臟=0.30*LDH+0.29*ROS+0.29*ATP+0.27*MDA+0.25*GPT+0.21*CAT+0.18*SOD+0.07*GOT。分析結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建的組織特異性抗逆綜合指數(shù)與年齡呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，與組織能量代謝水平及抗氧化脅迫能力呈正相關(guān)，且腎臟中指數(shù)的變化與年齡相關(guān)性最好（r=0.82，P值=9.22e-11）。

5、
　　2、生殖及高溫脅迫對(duì)櫛孔扇貝能量代謝及抗氧化脅迫能力的影響
　　我們利用構(gòu)建的櫛孔扇貝組織特異性抗逆相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，分析了生殖及高溫脅迫對(duì)櫛孔扇貝各組織能量代謝水平及抗氧化能力的影響?；A(chǔ)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，與正常扇貝個(gè)體相比，繁殖期櫛孔扇貝大部分組織的SOD、CAT、GOT、GPT、LDH酶活力水平以及ROS、ATP水平在大部分組織中顯著下降（P<0.05），其中性腺的抗氧化酶活力降幅達(dá)90％，ATP水平降幅達(dá)8

6、0%；另外，產(chǎn)后外套膜、鰓、性腺、腎臟、閉殼肌及肝胰腺的綜合指數(shù)顯著下降（P<0.05）。30℃高溫刺激生存曲線分析結(jié)果表明，1齡實(shí)驗(yàn)組存活率顯著高于2齡以上實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）。統(tǒng)計(jì)顯示，12.5h時(shí)1齡實(shí)驗(yàn)組存活率達(dá)89.69%，2齡實(shí)驗(yàn)組存活率達(dá)37.72%，而3、4齡及產(chǎn)后實(shí)驗(yàn)組存活率已低于15%。分析結(jié)果表明，高溫脅迫下組織基礎(chǔ)生理指標(biāo)仍呈現(xiàn)增齡性下降趨勢(shì)，1齡實(shí)驗(yàn)組綜合指數(shù)顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P<0.05），與正常1-4齡

7、檢測(cè)結(jié)果一致。高溫脅迫前后比較分析結(jié)果顯示，2齡以上實(shí)驗(yàn)組扇貝組織能量代謝及抗氧化脅迫能力評(píng)價(jià)綜合指數(shù)在高溫刺激后顯著下降（P<0.05）；1齡大部分組織該綜合指數(shù)變化不顯著，但腎臟及肝胰腺綜合指數(shù)在高溫刺激后反而呈顯著上升（P<0.05）。本研究結(jié)果表明，生殖及高溫脅迫均可造成櫛孔扇貝組織抗逆性綜合指數(shù)下降，暗示了這兩種因素均可對(duì)扇貝的能量代謝水平及抗氧化能力產(chǎn)生顯著影響。
　　3、生長(zhǎng)、代謝、衰老及繁殖相關(guān)基因調(diào)控通路表達(dá)分析

8、
　　參與調(diào)控 Mn-SOD、CAT、GPT等轉(zhuǎn)錄活性上游的PI3K-AKT-TOR、IGF-1r-AMPK-FOXO及P53-Sestrin通路相關(guān)基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，櫛孔扇貝大部分組織中包括PI3K、IGF-1r、AKT、AMPK、TOR等基因在內(nèi)的通路衰老正向調(diào)控軸基因在正常情況及高溫脅迫下均呈現(xiàn)增齡性表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)，且在產(chǎn)后及高溫刺激后的部分組織中表達(dá)顯著上升（P<0.05）。腎臟中，PI3K、IGF-1r、AMPKα/