梅氏新貝尼登蟲組織蛋白酶b克隆和序列分析【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　梅氏新貝尼登蟲組織蛋白酶B克隆和序列分析</p><p>　　摘要：組織蛋白酶B（cathepsin B，CB）為半胱氨酸蛋白酶，具有廣譜的蛋白水解活性。本文就CB的生物學(xué)特性與生理功能及酶學(xué)性質(zhì)，酶原

2、如何激活，CB與腫瘤擴(kuò)散和細(xì)胞凋亡的關(guān)系以介紹，并對(duì)CB的抑制劑和應(yīng)用方面的研究做了總結(jié)，最后總結(jié)了CB的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。</p><p>　　關(guān)鍵詞：組織蛋白酶B；細(xì)胞凋亡；抑制劑；基因結(jié)構(gòu)；表達(dá)調(diào)控</p><p>　　1 組織蛋白酶B簡介</p><p>　　組織蛋白酶B（cathepsin B，CB）為半胱氨酸蛋白酶，在酸性pH的溶酶體中，CB

3、主要是外肽酶，若在中性或堿性pH環(huán)境中，CB則為內(nèi)肽酶（徐昌隆等，2004；李杰平等，2008）。CB的此種水解蛋白的雙重活性，使其蛋白水解范圍很廣。CB存在于細(xì)胞質(zhì)和溶酶體中，其活性中心有巰基，可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，進(jìn)而破壞組織屏障(趙艷艷等，2008)。</p><p>　　CB廣泛存在于細(xì)菌、昆蟲和哺乳動(dòng)物中。溶酶體的降解蛋白質(zhì)過程中，CB發(fā)揮著重要的作用，血漿蛋白、激素和細(xì)菌等被溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶類水解

4、。CB對(duì)多種昆蟲，如棉鈴蟲、蚊等的卵黃磷蛋白水解活性高，提供胚胎發(fā)育必要的營養(yǎng)物質(zhì)（杜欣軍等，2004）。</p><p><b>　　2 CB酶學(xué)性質(zhì)</b></p><p>　　日本血吸蟲CB基因所編碼的蛋白分子量39.5kD，不含有亮氨酸。5—20位氨基酸區(qū)域可能為跨膜結(jié)構(gòu)域，CB信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在第26和27位氨基酸之間。蛋白序列中含有一個(gè)肽酶C1催化結(jié)構(gòu)域，含

5、有半胱胺酸蛋白酶活性位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)，因此推測(cè)此蛋白的活性可能會(huì)受磷酸化作用調(diào)節(jié)。研究海參CB酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，CB最適溫度為40℃，最適pH為5.5（趙露露等，2008）。</p><p><b>　　3 CB酶原激活</b></p><p>　　無活性的前體酶原水解后變成成熟的組織蛋白酶，前體酶原由含有成熟酶活性中心的催化域和信號(hào)肽前體肽二者構(gòu)成。信號(hào)肽負(fù)責(zé)將核糖體表

6、達(dá)的前體酶原蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被水解形成酶原。酶原通過蛋白水解，變?yōu)榉肿恿?0kDa的成熟單鏈形式，再作經(jīng)進(jìn)一步的裂解，最后才形成具有活性的成熟組織蛋白酶B。</p><p>　　溶酶體內(nèi)的CB，首先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體內(nèi)合成無活性酶原，到胞漿糖基化，糖基在高爾基體中被磷酸化修飾，形成甘露糖一6一磷酸蛋白，溶酶體上的6一磷酸甘露糖受體能對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)而胞飲入溶酶體內(nèi)。CB有兩種成熟形式，雙鏈的形式或

7、單鏈形式(楊麗等，2008)。</p><p>　　4 CB與腫瘤和細(xì)胞凋亡</p><p><b>　　4.1 CB與腫瘤</b></p><p>　　一方面，研究表明CB與瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。exon2和exon3以及激活前體蛋白肽的7個(gè)氨基酸殘基在腫瘤時(shí)缺失，形成了特殊的mRNA產(chǎn)物，蛋白質(zhì)合成后因其缺失信號(hào)肽，所以不能沿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑進(jìn)

8、入溶酶體而彌散于胞漿中，在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中，CB可以直接溶解細(xì)胞外基質(zhì)，產(chǎn)生可降解如層粘素、纖維連接蛋白等成分的酶，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞向組織深部的浸潤（華靜等，2002）。瘤細(xì)胞分泌的CB不能被攝人的溶酶體，因其缺乏甘露糖一6一磷酸受體識(shí)別標(biāo)記。利用免疫組化及原位雜交技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)CB在許多的種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較高（劉顧等，2008）。</p><p>　　另一方面來講，血管被CB通過多種機(jī)制促進(jìn)形成，進(jìn)而促使腫

9、瘤生長。CB降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，會(huì)從細(xì)胞外基質(zhì)中釋放促血管生長因子，促進(jìn)血管生成。另外，CB還可以降解金屬基質(zhì)蛋白酶的抑制劑，直接或間接促進(jìn)血管生成（肖慶等，2008；王中顯等，2006）。</p><p>　　4.2 CB與細(xì)胞凋亡</p><p>　　促凋亡蛋白Bid被CB裂解后，細(xì)胞色素C從線粒體被釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的瀑布效應(yīng)。這表明組織蛋白酶B與細(xì)胞凋亡存在著緊密的關(guān)系（李杰

10、平等，2007）。CB基因被剔除了的小鼠，對(duì)于TNF-α介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡和肝損傷有阻斷作用。CB還參與了WEHI—S纖維肉瘤中TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這也同時(shí)說明了CB有截然相反的兩個(gè)作用：既可以促使瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織的侵襲；也可以促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡。</p><p>　　組織蛋白酶B有兩條途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡：組織蛋白酶B不依賴于caspases的細(xì)胞凋亡途徑；組織蛋白酶B依賴于caspases的細(xì)胞凋亡途徑（李杰平等，2

11、007；王翠芬等，2008）。</p><p><b>　　5 CB抑制劑</b></p><p>　　人類的CB的抑制劑均屬于內(nèi)源性的蛋白抑制劑，且專一性較差。惡性腫瘤中CB與CB抑制劑之間生理平衡的破壞，及CB抑制劑的表達(dá)下降，造成了CB活性的增加。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，有CB同其抑制劑共同作用的參與。CB抑制劑有潛在治療和控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，目前CB抑制劑已成

12、為研究抗腫瘤藥物的一個(gè)重要研究方向（肖慶等，2008）。</p><p>　　CB有三類主要的抑制劑：一類為kininogens，其對(duì)CB的抑制作用較弱；第二類為cystatins，主要包括cystatinC，cystainC是對(duì)CB親和力最大的蛋白；第三類為stefins，包括stefinC、stefinA和stefinB。</p><p>　　最近又發(fā)現(xiàn)了五種對(duì)組織蛋白酶B具有較好抑制

13、活性的黃烷醇類天然化合物抑制劑：proeyanidinB-2，prodelphinidinB-23'-O-gallate，(-)epigallocatechin-3-0-gallate，prodelphinidinB-2和puerinA，其IC50值分別為0.76，0.58，0.96，0.44和2.07μmol/L。這五種抑制劑是組織蛋白酶B的新型天然的抑制劑（賈銳銳等；2008）。</p><p>　　

14、大腸癌患者的cystatinC比正常時(shí)增加1.6倍，其抑制劑的含量雖增加，但增加的抑制劑并未平衡相應(yīng)增加的組織蛋白酶B酶活性，即組織蛋白酶B和其抑制劑處于失平衡狀態(tài)。因此，可以將組織蛋白酶B的抑制劑與其比值用來作為斷定腫瘤惡性程度（喬鎮(zhèn)等，2008；劉頤等，1998）。</p><p><b>　　6 CB應(yīng)用研究</b></p><p><b>　　6.1

15、 CB疫苗 </b></p><p>　　日本血吸蟲的CBDNA疫苗(Si31BIN)給小鼠接種后，結(jié)果顯示日本血吸蟲CBDNA疫苗具有高度的抗生殖免疫作用（易新元等，2000）。體外轉(zhuǎn)錄合成CB基因的特異性siRNA并轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，結(jié)果表明不同濃度的siRNA對(duì)CB及mRNA的表達(dá)都有抑制效應(yīng)（婁欣等，2007）。進(jìn)一步的研究表明，疫苗使小鼠獲得了抗血吸蟲感染的能力（田明禮等，2001）。因

16、此推測(cè)，Sj31B1N免疫后產(chǎn)生了細(xì)胞免疫，對(duì)血吸蟲的產(chǎn)卵和發(fā)育具有一定的影響，這給人類的抗寄生蟲感染帶來了新希望（曾憲忠等，2001）。</p><p>　　6.2 CB抑制劑的應(yīng)用</p><p>　　巰基蛋白酶抑制劑在防治病蟲害上面，顯示了廣闊的應(yīng)用前景。因?yàn)镃B消化酶活性被抑制劑抑制，會(huì)引起昆蟲正常代謝的擾亂，甚至導(dǎo)致死亡。當(dāng)前，已經(jīng)克隆了水稻、玉米等l5種不同來源蛋白酶抑制劑的c

17、DNA，并轉(zhuǎn)入到不同植物中，其中大部對(duì)昆蟲有明顯抗性。CB抑制劑還有潛在的控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，已成為研究抗寄生蟲感染、抗腫瘤疾病藥物的重要研究方向。</p><p>　　6.3 CB在食品工業(yè)中的應(yīng)用</p><p>　　CB在食品工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。CB能將肌肉中的蛋白質(zhì)分解成游離氨基酸和多肽，進(jìn)而降解成風(fēng)味成份——醛類和酮類化合物。CB能降解原肌蛋白、肌球蛋白等蛋白，在肉加工時(shí)

18、的嫩化、成熟中發(fā)揮重要作用（趙改名等，2003）。</p><p>　　7 CB基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)</p><p>　　CB基因的核苷酸有一定的保守性，不同種動(dòng)物及不同組織的CB序列具有相似的結(jié)構(gòu)與組成。日本血吸蟲CB基因序列與曼氏血吸蟲CB肽鏈內(nèi)切酶基因序列高度同源(85％的同一性)，編碼348個(gè)氨基酸（胡永軒等，2004）。</p><p>　　鼠的CB基因由10個(gè)外

19、顯子(exon)和9個(gè)內(nèi)含子(intron)組成，催化活性位點(diǎn)被內(nèi)含子分開，5′端具有TATA盒和信號(hào)肽。禽的CB基因共編碼340個(gè)氨基酸，與鼠的CB序列很相似（Dong等，2004）。</p><p>　　8 CB基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制</p><p>　　CB表達(dá)的調(diào)節(jié)，存在著基因、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平，以及翻譯、翻譯后修飾等多水平的調(diào)節(jié)（李美寧，2005）。轉(zhuǎn)錄因子，如Ets1、CBBP和Sp

20、1等均在轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用。視黃酸、鈣化醇等，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平都起著調(diào)控CB表達(dá)的作用（Isabelle M. Berquin等，1999）。另外，mRNA異常的表達(dá)也可以致使CB的外泄，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯等過程中，都能影響到CB的活力。反義RNA技術(shù)可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行負(fù)調(diào)控(盧士英等，2004)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>

21、　　[1] 徐昌隆,黃智銘,陳民新,等.組織蛋白酶B及其基因在肝癌中的表達(dá)及意義[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,34(6):414-416.</p><p>　　[2] 李杰平,張平,張書杰,等.實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠肺組織Cathepsin B表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(1):65-68.</p><p>　　[3] 趙艷艷,劉建兵,羅梅浩,等.煙夜蛾組織蛋白酶

22、B酶原基因的克隆、序列分析和原核表達(dá)[J].昆蟲學(xué)報(bào),2008,51(11):1121-1128.</p><p>　　[4] 杜欣軍,邵紅蓮,邵丁丁,等.棉鈴蟲組織蛋白酶B酶原在大腸桿菌中的表達(dá)及純化[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2004,12(2):162-166.</p><p>　　[5] 趙露露,董秀萍,于蕾,等.海參體壁組織蛋白酶B酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].食品研究與開發(fā),2008,2

23、9(8):5-9.</p><p>　　[6] 楊麗,陳清江.宮頸鱗癌組織中組織蛋白酶B、層粘連蛋白表達(dá)及其意義[J].醫(yī)學(xué)論壇雜志,2008,29(17):13-15.</p><p>　　[7] 華靜,任衛(wèi)平,陸倫根,等.不同亞型胃癌細(xì)胞株裸鼠移植瘤中組織蛋白酶B的表達(dá)[J].胃腸病學(xué),2002,7(3):163-165.</p><p>　　[8] 劉顧,施堯

24、,王利民,等.原位雜交檢測(cè)胃癌組織中組織蛋白酶B的表達(dá)[J].中華消化雜志報(bào),1998,18(8):181-182. </p><p>　　[9] 肖慶,唐深,樊曉暉.組織蛋白酶B及抑制劑與腫瘤[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2008,16(4):674-676.</p><p>　　[10] 王中顯,劉少揚(yáng),江大瓊.組織蛋白酶B在卵巢癌中的表達(dá)及意義[J].腫瘤,2006,26(6):559-56

25、2.</p><p>　　[11] 李杰平,何平平,于小華,等.大鼠肺纖維化細(xì)胞凋亡及Cathepsin B基因變化的關(guān)系[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,5(2):696-698.</p><p>　　[12] 李杰平,張平.組織蛋白酶B與細(xì)胞凋亡及肺纖維化的關(guān)系[J].國際呼吸雜志,2007,27(4):295-297.</p><p>　　[13] 王翠芬,

26、陳敏,等.溶酶體cathepsinB參與大黃素誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,27(6):404-408</p><p>　　[14] 肖慶,唐深,樊曉暉.組織蛋白酶B及抑制劑與腫瘤[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2008,4:674-676.</p><p>　　[15] 賈銳銳,曾廣智,等.組織蛋白酶B的新型天然抑制劑[J].云南植物研究.2008,30(5):62

27、1-623.</p><p>　　[16] 喬鎮(zhèn),關(guān)景明,汪麗燕.組織蛋白酶B及其抑制劑CYSTATINC與大腸腺瘤及大腸腺癌關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2008,10(6):749-750.</p><p>　　[17] 楊正時(shí).海魚弧菌感染[J].國外醫(yī)學(xué).微生物學(xué)分冊(cè),1989,8(2):81-83.</p><p>　　[18] 易新元,曾憲忠,汪世

28、平,等.日本血吸蟲組織蛋白酶BDNA疫苗抗生殖免疫的研究[J].中國人獸共患病雜志,2000,16(1):45-47.</p><p>　　[19] 婁欣,張紅,曹學(xué)全,等.組織蛋白酶B特異性siRNA對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞組織蛋白酶B基因表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,42(1):14-17.</p><p>　　[20] 曾憲忠,易新元,曾憲芳.日本血吸蟲組織蛋白

29、酶B核酸疫苗血清抗體與抗生殖免疫關(guān)系的初步研究[J].中國人獸共患病雜志,2001,17(4):40-42.</p><p>　　[21] 田明禮,易新元,曾憲芳,等.日本血吸蟲31kDa組織蛋白酶BDNA疫苗保護(hù)性免疫效果觀察[J].中國血吸蟲病防治雜志,2001,13(4):209-212.</p><p>　　[22] 趙改名,周光宏,徐幸蓮.肌肉內(nèi)源蛋白酶及其在干腌火腿加工過程中的

30、作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(4):70-74.</p><p>　　[23] 胡永軒,肖建華,曾橋,等.日本血吸蟲組織蛋白酶B肽鏈內(nèi)切酶基因的獲得及結(jié)構(gòu)與功能分析[J].中國人獸共患病雜志,2004,20(9):790-793.</p><p>　　[24] Dong SS, Stransky G I, Whitaker C H, el a1. Avian cathepsi

31、n B cDNA: Sequence and demonstration that mRNAs of two sizes are produced in cell types producing large quantities of the enzyme[J]. Biochimica et Biophysica Acta. 1995, 125l: 6973.</p><p>　　[25] 李美寧. 組織蛋白酶B

32、與腫瘤[J]. 國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè), 2005, 32(6): 429-432. </p><p>　　[26] Berquin I M, Yan S, Katiyar K, el a1. Differentiating agents regulate cathepsin B gene expression in HL-60 cel[J]. J Leukoc Biol, l999, 66(4): 609-616.