大珠母貝和企鵝珍珠貝組織蛋白酶D基因及α-淀粉酶基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、大珠母貝(Pinctadamaxima)分布于中國、澳大利亞和東南亞沿岸熱帶和亞熱帶海域，是世界上最優(yōu)質(zhì)的育珠貝，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值。企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)主要分布于我國兩廣、海南、臺灣沿海以及日本九州的南部，琉球群島直至菲律賓等地，主要用于培育附殼珠和大型游離珍珠。
　　 本研究通過同源克隆方法獲得了大珠母貝和企鵝珍珠貝的組織蛋白酶D基因和a-淀粉酶基因，并對其序列特征和組織表達(dá)進(jìn)行了分析；為進(jìn)一步研究組織蛋

2、白酶D在免疫方面的功能和作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為探討大珠母貝養(yǎng)殖死亡原因積累資料；為篩選a-淀粉酶基因的SNP多態(tài)位點(diǎn)、開展SNP多態(tài)位點(diǎn)和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析奠定基礎(chǔ)。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1、通過同源克隆方法和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)，獲得了大珠母貝(Pinctadamaxima)組織蛋白酶D基因(命名為pmCTSD)的cDNA全長序列1742bp，其中5，非翻譯區(qū)(UTR)38bp，3’UTR534b

3、p，開放閱讀框1170bp，編碼390個氨基酸，分子量約為41.9ku，等電點(diǎn)約為7.57。序列特征分析表明，pmCTSD蛋白由信號肽(Met1-Ala18)、前體域(Leu19-Lys47)和成熟域(Thr4s-Asn390)3部分組成。同源性分析表明，pmCTSD氨基酸序列與其他物種高度保守，一致性介于64％～70％之間。進(jìn)化分析表明，pmCTSD與櫛孔扇貝親緣關(guān)系最近，與傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致。組織表達(dá)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，pmCTSD

4、在閉殼肌、性腺、肝胰臟、外套膜和鰓組織中都有表達(dá)，但在性腺中表達(dá)量最高，肝胰臟次之。經(jīng)哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)浸泡刺激6h后，pmCTSD基因的mRNA表達(dá)水平在肝胰臟中表達(dá)量最高并略有上升但差異不顯著(P>0.05)，在其他組織中表達(dá)量均很低，其中性腺顯著下調(diào)(P<0.01)。上述結(jié)果為進(jìn)一步開展pmCTSD的功能研究奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 2、企鵝珍珠貝組織蛋白酶D基因(命名為pgCTSD)cDNA全長1，7

5、67bp，其中5，UTR為38bp，3，UTR為553bp，ORF1，176bp，編碼392個氨基酸，包括信號肽(Met1-Ala18)、前體域(Leu19-Lys47)和成熟域(Tyr48-Ser392)3部分，分子量為42.3KDa，等電點(diǎn)為8.04。pgCTSD一級結(jié)構(gòu)包含2段天冬氨酸蛋白酶簽名序列(Val84-Val95和Ala272-Gly283)、2個N-連接的糖基化位點(diǎn)(Asn124和Asn237)。pgCTSD與大珠母貝

6、的一致性最高(79％)，與其他物種的一致性在59％～75％之間。NJ樹表明企鵝珍珠貝與櫛孔扇貝聚在一小支，然后與大珠母貝聚在一起。熒光定量分析表明，空白組中pgCTSDmRNA在閉殼肌、性腺、肝胰臟、外套膜和鰓組織中都有表達(dá)，且在閉殼肌中表達(dá)量最少，肝胰臟中最高。與空白組相比，注射PBS6h后，pgCTSDmRNA在閉殼肌和性腺的表達(dá)量顯著上調(diào)，肝胰臟下調(diào)，但在各組織中保持最高表達(dá)量，外套膜和鰓組織顯著下調(diào)。與對照組相比，LPS刺激6h

7、后，閉殼肌的表達(dá)量顯著上調(diào)，性腺和肝胰臟顯著下調(diào)，外套膜和鰓組織變化不顯著；哈維氏弧菌刺激6h后，在鰓組織中顯著上調(diào)，外套膜中顯著下降，性腺中無顯著變化。上述結(jié)果為進(jìn)一步開展pgCTSD的功能研究奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 3、首次獲得大珠母貝α-淀粉酶基因(命名為pmAMY)的cDNA全長1，732bp，其中5，UTR25bp，ORF1，554bp，編碼518個氨基酸，3’UTR153bp，分子量為57.7KDa，等電點(diǎn)7.63。

8、序列分析表明pmAMY的氨基酸序列包括16個氨基酸組成的信號肽(Met1-Gly16)，序列為MLUVCSIAFFHsVYG；8個半胱氨酸位點(diǎn)(Cys46、Cys104、Cys157、Cys176、Cys392、Cys398、Cys464、Cys476)、3個活性催化位點(diǎn)(Asp213、Glu249、Asp314)、4個鈣結(jié)合位點(diǎn)(Asnus、Arg174、Asp183、His217)、3個氯離子結(jié)合位點(diǎn)(Arg211、Asn312、A

9、rg350)和4段保守序列(Ile111-Val116、Val207-Ala215、Phe247-Val251、Val308-Asn315。pmAMY與長牡蠣(Crassostreagigas)一致性最高達(dá)79％，與其他物種的一致性在57％～62％之間。克隆獲得大珠母貝pmAMY基因序列，含3個外顯子和2個內(nèi)含子。其中第一外顯子117bp，編碼39個氨基酸；第二外顯子152bp，編碼50個氨基酸；第三外顯子1，288bp，編碼429個氨

10、基酸。第一個內(nèi)含子846bp，第二個內(nèi)含子162bp。大珠母貝pmAMY基因的2個內(nèi)含子都起始于GT，終止于AG，符合內(nèi)含子共同剪接位點(diǎn)序列。
　　 4、企鵝珍珠貝α-淀粉酶基因(命名為pgAMY)cDNA全長1，670bp，其中5’UTR18bp，3，UTR83bp，ORF1，569bp，編碼523個氨基酸，分子量為62.4KDa，等電點(diǎn)8.7。序列分析表明pgAMV包括20個氨基酸組成的信號肽(Met1-Gly20)，序列為

11、MRTFFLTVCVLVLHSTVG：8個半胱氨酸位點(diǎn)(Cys50、Cys108、Cys162、Cys181、Cys397、Cys403、Cys469、Cys481)、3個活性催化位點(diǎn)(Asp218、Glu254、Asp319)、4個鈣結(jié)合位點(diǎn)(Asn122、Arg179、Asp188、His222)、3個氯離子結(jié)合位點(diǎn)(Arg216、Asn317、Arg355)和4段保守序列(Ile115-Val120、Val212-Ala220、P

12、he252-Val256、Val313-Asn32。pgAMY與長牡蠣一致性最高為83％，與大珠母貝一致性為82.8％，與其他物種的一致性在57％～67％之間。饑餓實(shí)驗(yàn)中對照組pgAMY的表達(dá)量最高，2-△△CT值為1。饑餓1周后表達(dá)量下降到對照組的43％(P<0.5)，饑餓4周后表達(dá)量與饑餓1周無明顯變化，為對照組的51％，投喂1天后pgAMY的表達(dá)量與饑餓4周的相比稍有下降，為對照組的39％。不同鹽度刺激24h后，鹽度33的pgAM