l型電壓門控鈣通道α1c亞基羧基末端肽段真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

1、<p>　　L型電壓門控鈣通道α1C亞基羧基末端肽段真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)</p><p>　　【摘要】 目的 構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)標(biāo)記的L型電壓門控鈣通道(L-type voltage-gated calcium channels， L-VGCCs) α1C亞基羧基末端肽段(CT，1587-2169)的真核表達(dá)載

2、體，并在COS-7細(xì)胞中表達(dá)。方法 采用RT-PCR方法擴(kuò)增CT的cDNA，克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1；采用PCR方法擴(kuò)增標(biāo)簽蛋白EGFP的cDNA，克隆至重組體pcDNA3.1-CT，EGFP位于CT的羧基末端；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組體pcDNA3.1-CT-EGFP轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過熒光顯微鏡和免疫印跡等方法檢測(cè)重組體的表達(dá)。結(jié)果 擴(kuò)增了CT和EGFP的cDNA；構(gòu)建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表達(dá)載體經(jīng)限制

3、性內(nèi)切酶酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)了其序列的正確性；熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞中觀察到綠色熒光，免疫印跡分析顯示pcDNA3.1-CT-EGFP轉(zhuǎn)染組有明顯條帶。結(jié)論 成功構(gòu)建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表達(dá)載體，并且在COS-7細(xì)胞</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 L-型電壓門控鈣通道 α1C亞基 克隆 表達(dá) </p><p>　　Abstract:Objective

4、 To construct and express in COS-7 cells the enhanced green fluorescent protein (EGFP) tagged carboxyl terminal sequence (CT, 1587-2169) of L-type voltage-gated calcium channel α1C subunits.Methods The CT cDNA was ampl

5、ified by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1. EGFP cDNA was amplified by PCR and cloned into pcDNA3.1-CT recombinant. EGFP was tagged to the C-terminus of the full-length CT. The recombinant was

6、transfected to COS-7 cells by the method o</p><p>　　Key words: L-type voltage-gated calcium channels; α1C subunits; clone; expression </p><p>　　神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+超載是缺血性腦損傷的關(guān)鍵因素，電壓門控鈣通道(voltage-gated calc

7、ium channels, VGCCs)是介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的主要方式之一［1］。L型電壓門控鈣通道(L-VGCCs) 廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2-3］，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞膜除極時(shí)開放，胞外的鈣離子流入胞內(nèi)，參與胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)興奮性的調(diào)控，與突觸可塑性［4］、基因表達(dá)［5-6］、激素分泌［7］等多種神經(jīng)元生理過程有關(guān)。 </p><p>　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)L-VGCCs是由α1、β、α2、δ亞基組成的糖基化多肽復(fù)

8、合體，α2亞基位于胞外，α1和δ亞基為跨膜亞基，β亞基位于胞內(nèi)。其中α1亞基是形成離子通道的主要功能亞基，其他亞基主要起調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)型L-VGCCs 的α1亞基主要是α1C和α1D亞型［8］。α1C(Cav1.2)亞基主要分布在海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)等對(duì)缺血敏感腦區(qū)的神經(jīng)元胞體和近端的樹突［8］，其位于胞內(nèi)的C端包含多個(gè)功能基序和結(jié)構(gòu)域，有EF手基序(EF hand motif)、1-8-14基序(1-8-14 motif)、LA 基

9、序(LA motif)、CB基序(calmodulin-binding motif， CB motif)、C端結(jié)合區(qū)、富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(proline-rich domain, PRD)和C端抑制性結(jié)構(gòu)域等，上述基序和結(jié)構(gòu)域通過與其他信號(hào)分子相互作用而調(diào)控通道的功能［1］。本研究構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)標(biāo)記的α1C亞基羧基末端肽段(含1587-2169位氨

10、基酸殘基，簡(jiǎn)稱CT)的真核表達(dá)載體pcDNA3.1</p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 載體、菌株和細(xì)胞株 質(zhì)粒pcDNA3.1(+)購自Invitrogen公司，pGEM-T 載體購自Promega公司；大腸桿菌JM101、COS-7細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。 </p><p>　　1.2 主

11、要試劑 總RNA提取試劑盒、PCR Master Mix試劑盒、DNA 純化試劑盒、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和Apa Ⅰ為Promega公司產(chǎn)品；Takara Ex Taq試劑盒為Takara公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000和1kb Plus DNA Ladder為Invitrogen公司產(chǎn)品；DMEM購自GIBCO公司；新生牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；鼠抗EGFP抗體購自Clo

12、ntech公司；堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自Sigma公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 </p><p>　　1.3 引物設(shè)計(jì) </p><p>　　1.3.1 CT cDNA擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank中的大鼠α1C的cDNA序列(NM012517)，以4759-4761位編碼甲硫氨酸的ATG作為擴(kuò)增序列的起始密碼子，以6507位作為擴(kuò)增序列結(jié)束的

13、位置，設(shè)計(jì)特異性上下游引物(下劃線為酶切序列)： </p><p>　　P1: GCCAAGCTTATGTTCAATGCTACACT (Hind Ⅲ)； </p><p>　　P2: GAATTCGTTGCTGACATAGGACCTGC (EcoR Ⅰ)。 </p><p>　　1.3.2 EGFP cDNA擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì) 根據(jù)EGFP的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性上

14、下游引物(下劃線為酶切序列)： </p><p>　　P3: GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG (EcoR Ⅰ)； </p><p>　　P4: GGGCCCCTACTTGTACAGCTCGTC (Apa Ⅰ)。 </p><p>　　1.4 總RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增CT cDNA SD雄性大鼠(清潔級(jí), 由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，R

15、NA提取試劑盒提取大鼠海馬總RNA。以提取的總RNA為模板，使用Takara Ex Taq試劑盒，先以寡聚T作為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)參數(shù)為：室溫10 min, 1個(gè)循環(huán)，42℃ 1 h，1個(gè)循環(huán)；冰水中2 min，1個(gè)循環(huán)。然后以P1和P2為上下游引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 4 min，1 個(gè)循環(huán)； 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，28個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 </p>

16、;<p>　　1.5 pcDNA3.1-CT真核表達(dá)載體的構(gòu)建 1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳、DNA純化試劑盒回收純化目的基因片段，然后連入pGEM-T載體，篩選陽性重組子測(cè)序分析，DNA序列分析委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行。 </p><p>　　將測(cè)序正確的重組子分別經(jīng)Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切，亞克隆至pcDNA3.1載體。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM101，提取的質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ/

17、EcoR Ⅰ雙酶切鑒定重組子， 陽性重組子進(jìn)行序列測(cè)定。 </p><p>　　1.6 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以我室構(gòu)建的pcDNA3.1-EGFP(上、下游的酶切位點(diǎn)均為EcoR Ⅰ)為模板，使用PCR Master Mix試劑盒，以P3和P4為上下游引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)參數(shù)為: 94℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)

18、；72℃ 7 min，1個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。參照1.5方法連入pGEM-T載體。 </p><p>　　將測(cè)序正確的pcDNA3.1-CT與pGEM-T-EGFP分別用EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ進(jìn)行雙酶切，1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化酶切后的pcDNA3.1-CT和EGFP cDNA，將兩者連接，參照1.5方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM101，篩選，提取質(zhì)粒，Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ/Apa

19、 Ⅰ三酶切鑒定與測(cè)序。 </p><p>　　1.7 COS-7細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 COS-7細(xì)胞以含100 ml/L 新生牛血清的Dulbecco改良培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle media, DMEM)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度至90%～95%時(shí)，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Lipofectamine 2000)將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CT-EGFP及空質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染入COS-7

20、細(xì)胞中，用熒光顯微鏡觀察熒光情況，36 h后收集細(xì)胞，超聲破碎，以改良Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 </p><p>　　1.8 免疫印跡 蛋白質(zhì)樣品(100 μg)經(jīng)7.5% SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC 膜)上。NC膜在含3% BSA的封閉液中室溫孵育3 h后，鼠抗EGFP抗體 4℃孵育過夜，AP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，NBT/BCIP中顯色，掃描膜上顯色條帶。 </p>

21、<p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p><p>　　2.1 CT cDNA的擴(kuò)增 根據(jù)α1C的cDNA序列(Genbank， NM012517)，以大鼠海馬總RNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行CT cDNA的擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增出的cDNA與目的基因片段大小(1749 bp) 相符(圖1)。 </p><p>　　圖1 RT

22、-PCR產(chǎn)物電泳圖 </p><p>　　M. DNA Marker; CT. RT-PCR產(chǎn)物 </p><p>　　2.2 pcDNA3.1-CT真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 陽性重組子pGEM-T-CT測(cè)序分析結(jié)果顯示，CT cDNA序列與Genbank NM012517中4 759-6 507序列相比，有2個(gè)核苷酸不同(5877和5934)，屬于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，但表達(dá)的多肽氨基

23、酸序列是完全一致的。將測(cè)序正確的pGEM-T-CT重組子用Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切，回收目的片段，與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3.1載體連接。瓊脂糖凝膠電泳顯示，篩選出的陽性重組子經(jīng)Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切后有2條DNA條帶，其大小分別與載體pcDNA3.1 (5400 bp) 和CT cDNA(1749 bp)一致(圖2)，且測(cè)序結(jié)果正確。結(jié)果表明CT的cDNA已成功克隆至pcDNA3.1真核表達(dá)載體。 </p&g

24、t;<p>　　2.3 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將擴(kuò)增的EGFP cDNA(結(jié)果未顯示)連入pGEM-T載體，篩選陽性重組子，將測(cè)序正確的pcDNA3.1-CT與pGEM-T-EGFP分別用EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ進(jìn)行雙酶切，1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化酶切后的pcDNA3.1-CT和EGFP cDNA，將兩者連接。瓊脂糖凝膠電泳顯示，篩選出的陽性重組子經(jīng)Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ/Apa

25、Ⅰ三酶切后有3條DNA條帶，其大小分別與載體pcDNA3.1(5400 bp)、CT cDNA(1749 bp)和EGFP cDNA(720 bp)相一致(圖3)，且測(cè)序結(jié)果正確。 </p><p>　　圖2 pcDNA3.1-CT 的雙酶切產(chǎn)物電泳圖 </p><p>　　M. DNA Marker; CT. pcDNA3.1-CT Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切產(chǎn)物 </p&

26、gt;<p>　　圖3 pcDNA3.1-CT-EGFP的三酶切產(chǎn)物電泳圖 </p><p>　　M. DNA Marker; CE. pcDNA3.1-CT-EGFP Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ/Apa Ⅰ三酶切產(chǎn)物 </p><p>　　2.4 真核表達(dá)載體在COS-7細(xì)胞中的表達(dá) 將pcDNA3.1和pcDNA3.1-CT-EGFP分別以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染COS-7

27、細(xì)胞，熒光顯微鏡下，pcDNA3.1-CT-EGFP轉(zhuǎn)染組24 h后開始呈現(xiàn)明顯綠色熒光，并不斷加強(qiáng)(結(jié)果未顯示)。36 h后收集未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組COS-7細(xì)胞，樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，以鼠抗EGFP抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-CT-EGFP轉(zhuǎn)染組可檢測(cè)到明顯電泳條帶(圖4)。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的EGFP融合的CT真核表達(dá)載體在COS-7細(xì)胞中得到了高效表達(dá)。 </p><p>　　圖

28、4 未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組COS-7細(xì)胞 </p><p><b>　　免疫印跡分析圖 </b></p><p>　　1.COS-7； 2.pcDNA3.1； 3.pcDNA3.1-CT-EGFP </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　短暫性全腦缺血可誘發(fā)一系列病理

29、性反應(yīng)，最終導(dǎo)致海馬、皮質(zhì)等敏感性腦區(qū)的神經(jīng)元損傷。L-VGCCs 通過介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，在短暫性全腦缺血及再灌注的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演著重要的角色［1,9-10］。α1C亞基作為神經(jīng)型L-VGCCs的主要功能亞基，通過膜內(nèi)疏水的C端所包含的多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域與其他信號(hào)分子相互作用而調(diào)控通道功能［1］。針對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行深入研究，有可能發(fā)現(xiàn)新的缺血性腦損傷的治療藥物。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以海馬中總RNA為

30、模板，設(shè)計(jì)CT的特異性上下游引物，通過RT-PCR方法較靈敏和特異性地?cái)U(kuò)增到目的片段。測(cè)序分析結(jié)果表明，目的序列中存在著2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。在CT cDNA羧基末端插入EGFP cDNA，構(gòu)建EGFP融合的CT真核表達(dá)載體，為觀察蛋白表達(dá)情況提供了重要的依據(jù)。EGFP 融合的CT真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建和表達(dá)，為我們進(jìn)一步在體內(nèi)外研究α1C亞基的生物學(xué)功能及調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 </p><p><b&g

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