蘋果主栽品種β-1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化及抗病性狀檢測.pdf

1、本研究以蘋果（Malus domestica Borkh）主栽品種嘠拉（Gala）和富士（Fuji）組培苗為試材，研究了葉片離體再生和葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化的若干影響因素，優(yōu)化了蘋果葉片離體再生不定芽系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，獲得了攜帶β-1,3-葡聚糖酶基因的富士轉(zhuǎn)化株系，并對嘎拉和富士轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了PCR，PCR-Sourthern和RT-PCR檢測，成功獲得了有目的基因表達(dá)的嘎拉和富士轉(zhuǎn)化株系。進(jìn)行接種蘋果輪紋抗病檢測鑒定時，轉(zhuǎn)化株的β-1,3

2、-葡聚糖酶、PAL和PPO活性較非轉(zhuǎn)化株高，具有較強的抗病性。試驗結(jié)果表明：
　　 1.富士的不定芽再生培養(yǎng)基中直接加入10.0～15.0mg/L SNP可以顯著提高其再生效率。
　　 2.農(nóng)桿菌在不加入抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行二次懸浮時，部分農(nóng)桿菌會發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，隨懸浮培養(yǎng)時間的延長，丟失率顯著增高；質(zhì)粒丟失程度與目的基因、啟動子和農(nóng)桿菌菌株的組合有關(guān)；同時，在0.5 h～6.0 h懸浮時間范圍內(nèi)，質(zhì)粒丟失主要與菌液濃

3、度有關(guān)，而與懸浮時間關(guān)系不大；直接吸取一懸液或離心后分別懸浮于細(xì)菌培養(yǎng)液和植物培養(yǎng)液等不同的懸浮培養(yǎng)方式下質(zhì)粒穩(wěn)定性沒有差別。
　　 3.研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的各種因素，優(yōu)化了遺傳轉(zhuǎn)化途徑：外植體在蔗糖濃度為60～90g/L的分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1～2d；農(nóng)桿菌二次懸浮后OD600值0.3～0.4時在搖床上晃動侵染8min；干燥共培養(yǎng)2d后進(jìn)行脫菌、選擇、篩選。
　　 4.共有12個富士轉(zhuǎn)化株系通過了Kan抗性檢測

4、，具體包括三個方面：①轉(zhuǎn)化株在附加Kan50mg/L的繼代培養(yǎng)基上能夠連續(xù)增殖繼代，生長正常。②轉(zhuǎn)化株葉片在附加或未加Kan50mg/L的再生培養(yǎng)基上的再生能力無明顯差異。③轉(zhuǎn)化株在附加Kan50mg/L的生根培養(yǎng)基中能正常生根。
　　 5.通過Kan抗性篩選的12個富士株系經(jīng)PCR檢測有11個株系呈現(xiàn)陽性，再經(jīng)PCR-Southern blot檢測，證明17個嘎拉轉(zhuǎn)化株系和11個富士轉(zhuǎn)化株系的檢測結(jié)果全部呈現(xiàn)陽性，證明β-1,

5、3-葡聚糖酶基因已經(jīng)整合到嘎拉和富士植株基因組中。RT-PCR檢測顯示，β-1,3-葡聚糖酶基因在17個嘎拉轉(zhuǎn)化株系都有不同量的表達(dá)，而只在3個富士轉(zhuǎn)化株系中有少量表達(dá)。
　　 6.蘋果輪紋病菌在24～28℃較適宜菌絲體生長,24℃時分生孢子囊和分生孢子發(fā)生最多；培養(yǎng)基pH5.0以及接種后在黑光燈下培養(yǎng)有利于分生孢子囊和分生孢子產(chǎn)生；菌絲體生長到一定程度后，刮除菌絲體對分生孢子囊和分生孢子的發(fā)生有顯著促進(jìn)作用。
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